福建地區(qū)口腔癌患者p53基因72密碼子多態(tài)性與口腔癌易感性的研究

何保昌，陳 法，劉芳萍，柳迪萌，陳 珍，蔡 琳

吸煙、飲酒是口腔癌的主要危險(xiǎn)因素，但暴露于同樣環(huán)境因素中的人發(fā)生口腔癌的僅是一部分，這提示遺傳因素所決定的個(gè)體易感性在口腔癌演變過程中扮演著不可忽視的角色。Jing等在中國漢族人群中研究發(fā)現(xiàn)，p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性與口腔癌有關(guān)，特別是攜帶Pro等位基因可增加患口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]。但Saini和Jiang等的研究并未發(fā)現(xiàn)p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性與口腔癌有關(guān)[2－3]。近年來，p53基因第4外顯子72密碼子多態(tài)性與口腔癌的關(guān)系也受到廣大學(xué)者的研究，但結(jié)論尚存在爭議。鑒于此，本研究探討p53基因第4外顯子72密碼子多態(tài)性與口腔癌易感性的關(guān)系，并分析其與環(huán)境因素在口腔癌發(fā)生中的交互作用，力求更全面地探討p53基因多態(tài)性、環(huán)境因素與口腔癌的關(guān)聯(lián)，為口腔癌的預(yù)防和控制提供分子水平的依據(jù)，以提高口腔癌的三級(jí)預(yù)防水平。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，病例組149例，為2010年9月－2014年1月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科住院并經(jīng)病理確診的口腔癌新發(fā)病例；對(duì)照組303例，為同期進(jìn)行健康體檢的人群、其他科室的住院患者以及社區(qū)人群。病例組與對(duì)照組一般人口學(xué)特征的比較分析見表1。2組在性別、年齡、民族、婚姻狀況方面均衡可比（P＞0.05），但在職業(yè)、文化程度、居住地等方面的分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，病例組吸煙、飲酒、不良修復(fù)體等所占比例較大，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但在飲茶、腫瘤家族史方面差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)過福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 問卷調(diào)查及標(biāo)本采集 采用統(tǒng)一編制的調(diào)查表，由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員進(jìn)行面對(duì)面調(diào)查獲得研究對(duì)象的一般人口學(xué)特征、吸煙、飲酒以及飲茶等相關(guān)信息。飲酒指每周至少1次，持續(xù)半年以上者[4]；吸煙定義為累計(jì)吸煙100支以上者[5]；飲茶定義為每周至少1杯，持續(xù)半年以上[6]。病例對(duì)照人群采集抗凝血樣標(biāo)本，離心分離出白細(xì)胞，用裂解法提取DNA，用于p53基因型檢測。

1.3 基因檢測 引物序列由國際癌癥中心（IARC）提供，上海生工公司合成。

擴(kuò)增目的片段413bp。PCR反應(yīng)體系總量50μL，包括PCRmix 14.5μL、上下游引物各2.0μL、模板DNA 2.0μL，滅菌水加至50μL。擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性2min→94℃變性30s→60℃退火45s→72℃延伸120s，于PCR儀（480，美國PE公司）循環(huán)50次，72℃延伸10min。酶切反應(yīng)體系總量25μL，PCR產(chǎn)物10μL、10×Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、Bst UI酶1.0μL，37℃消化過夜。酶切后產(chǎn)物點(diǎn)樣于2.0%瓊脂糖凝膠中（凝膠中含5mg／mL的溴化乙錠），100V電泳45min，電泳液為1×TAE。停止電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并照相，Pro／Pro型可在413bp處出現(xiàn)1條帶，Arg／Arg型可在253和160bp處出現(xiàn)2條帶，Pro／Arg型可在160、253和413bp處出現(xiàn)3條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用χ2檢驗(yàn)對(duì)研究對(duì)象的一般人口學(xué)特征進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，運(yùn)用Hardy－Weinberg遺傳平衡定律判斷對(duì)照群體代表性；采用非條件Logistic回歸模型計(jì)算SNP位點(diǎn)與口腔癌關(guān)系的比值比（odds ratio，OR）、95%可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）及其相乘交互作用。利用叉生分析和Rothman提出的超額相對(duì)危險(xiǎn)度（RERI）、歸因比（AP）和交互作用指數(shù)（S）進(jìn)行相加交互作用分析[7]。以上分析均由Stata 12.1軟件包完成，所有P值均為雙側(cè)檢驗(yàn)結(jié)果，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

表1 病例組與對(duì)照組的人口學(xué)特征比較Tab 1 The comparison of demographic data of cases and controls

2 結(jié) 果

2.1 p53基因第4外顯子72密碼子多態(tài)性檢測結(jié)果 先對(duì)p53基因第4外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物陽性的再做限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），在413bp處擴(kuò)增出目的片段，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。p53基因第4外顯子經(jīng)內(nèi)切酶Bst UI酶消化后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)3種不同的電泳條帶（即3種不同的基因型），酶切結(jié)果見圖2。純合子Pro／Pro基因型因基因突變使酶切位點(diǎn)丟失，在413bp處出現(xiàn)1條帶，野生型純合子Arg／Arg基因型可在253和160bp處出現(xiàn)2條帶，雜合子Pro／Arg基因型在160、253和413bp出現(xiàn)3個(gè)片段。

圖1 p53基因第4外顯子PCR結(jié)果Fig 1 The result of p53gene exon4PCR

圖2 p53基因第4外顯子72密碼子多態(tài)性酶切結(jié)果Fig 2 The result of p53gene polymorphism restriction map on exon4condon 72

2.2 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)及基因位點(diǎn)遺傳模型分析 p53基因第4外顯子72密碼子在病例組和對(duì)照組中的基因型頻率分布進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡度檢驗(yàn)（表2），結(jié)果顯示各基因型的分布頻率符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），說明對(duì)照人群具有代表性。

表2 p53基因72密碼子多態(tài)性的Hardy－Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The result of p53gene codon 72polymorphism Hardy－Weinberg test

2.3 p53基因72密碼子多態(tài)性與口腔癌易感性的研究 與對(duì)照組相比，病例組p53基因攜帶Pro／Pro基因型是發(fā)生口腔癌的遺傳易感因素；經(jīng)性別、年齡、職業(yè)、民族、教育程度、體質(zhì)量指數(shù)、居住地、婚姻狀況、腫瘤家族史調(diào)整后，結(jié)果仍然一致，與Arg／Arg基因型及 Arg／Arg＋Arg／Pro基因型相比，p53基因攜帶Pro／Pro基因型的OR值分別為1.837（1.016，3.325）、2.189（1.389，3.449）。結(jié)果見表3。

表3 p53基因72密碼子多態(tài)性與口腔癌易感性的研究Tab 3 Study on the susceptibility of p53gene codon 72polymorphism and oral cancer

2.4 p53基因72密碼子多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用 與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未吸煙者相比，攜帶Pro／Pro基因型的未吸煙者和吸煙者患口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加，其OR值及95%CI分別為 2.286（1.352，3.865）和 7.672（3.567，16.503）。但并未發(fā)現(xiàn)p53基因攜帶Pro等位基因與吸煙存在相乘及相加交互作用。

與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未飲酒者相比，攜帶Pro／Pro基因型的飲酒者患口腔癌風(fēng)險(xiǎn)增 加 更 為 顯 著 （OR：11.406，95%CI：4.740，27.444）。而且p53基因攜帶Pro等位基因與飲酒之間存在顯著的相乘交互作用（OR相乘：4.375，95%CI：1.646，11.627），但并未發(fā)現(xiàn)它們之間存在相加交互作用。

與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未飲茶者相比，攜帶Pro／Pro基因型的飲茶者患口腔癌風(fēng)險(xiǎn)增加3.108倍（1.587，5.739），但并未發(fā)現(xiàn)p53基因攜帶Pro等位基因與飲茶之間存在顯著的相乘及相加交互作用（表4）。

3 討 論

3.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡 目前認(rèn)為在分析基因多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)時(shí)，要求對(duì)照基因型需符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，用以說明研究的人群選擇來自隨機(jī)婚配的群體，且樣本量足夠大。本次研究對(duì)照人群的p53基因第4外顯子72密碼子的多態(tài)性基因位點(diǎn)符合Hardy－Weinberg遺傳平衡，可以認(rèn)為本次研究對(duì)照人群具有人群代表性。

3.2 p53基因第4外顯子72密碼子的多態(tài)性與口腔癌易感性的關(guān)系 在腫瘤發(fā)生過程中，抑癌基因的失活和變異起著重要的作用。p53基因作為與人類腫瘤關(guān)系最為密切的抑癌基因而受到廣泛關(guān)注，其定位于人類染色體17p13.1，有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。p53基因第4外顯子72密碼子由于使G顛換成C而產(chǎn)生2個(gè)不同的等位基因Arg和Pro，這種p53基因72密碼子多態(tài)性會(huì)引起p53基因編碼蛋白功能發(fā)生改變，而P53蛋白是重要腫瘤抑制劑，發(fā)揮著基因衛(wèi)士的功能，主要參與啟動(dòng)細(xì)胞周期監(jiān)控、觸發(fā)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)受損的DNA修復(fù)。因此P53蛋白的功能發(fā)生改變后，便會(huì)引起機(jī)體對(duì)一些腫瘤的基因易感性[8－9]。

有實(shí)驗(yàn)表明，p53第4外顯子72密碼子2種基因編碼的P53Pro蛋白和P53Arg蛋白均為野生型，但兩者的生物學(xué)功能則不完全相同，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄激活作用、抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力等方面[10]。生物學(xué)功能的差異可能是P53Arg和P53Pro通過不同途徑選擇性地調(diào)節(jié)細(xì)胞特定功能的結(jié)果。

p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性的Arg／Arg、Pro／Arg、Pro／Pro 3種基因型在病例組的分布頻率分別為20.13%、44.30%、35.57%，在對(duì)照組的分布頻率分別為23.10%、55.12%、21.78%，野生型Arg／Arg基因在2組分布頻率差別不大。與Arg／Arg基因型及 Arg／Arg＋Pro／Pro基因型相比，攜帶Pro／Pro基因型使口腔癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分別增加1.837倍和2.189倍，表明人群攜帶Pro／Pro基因型可能是口腔癌的危險(xiǎn)因素，這與Jing等的研究結(jié)果一致[1]。原因可能是P53Pro對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及對(duì)細(xì)胞損傷的修復(fù)功能較P53Arg強(qiáng)所致，從而使機(jī)體在致癌因素的作用下易發(fā)生細(xì)胞的異常增生，導(dǎo)致腫瘤[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，Pro／Pro通過Fas／FasL途徑調(diào)節(jié)頭頸部腫瘤的細(xì)胞凋亡[12]，因P53Arg型頭頸部鱗癌患者缺乏Fas和FasL的共表達(dá)，而且抗凋亡蛋白Bcl－2高表達(dá)，從而減弱P53Arg誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力[13]。但Bau等研究發(fā)現(xiàn)，p53基因72密碼子的Arg／Arg基因與口腔癌的發(fā)生有關(guān)，與攜帶Pro／Pro基因型相比，攜帶Arg／Arg基因型可增加2.68倍患口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)（1.19，6.01）[14]。Drummond等研究表明，p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性與口腔癌無關(guān)[15]。研究結(jié)果不一致可能與p53基因多態(tài)性的分布受種族、地區(qū)、樣本量大小、研究對(duì)象的選擇、檢測方法等因素的影響，也可能受到其他混雜因素的干擾。p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性與口腔癌易感性的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用 眾所周知，腫瘤的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)腫瘤病因?qū)W研究已經(jīng)從單純的危險(xiǎn)因素分析過渡到揭示暴露因子與遺傳特征的聯(lián)合作用。隨著人們生活水平的提高，吸煙、飲酒、飲茶等生活習(xí)慣已經(jīng)成為多數(shù)人日常生活中不可或缺的一部分，生活方式與基因多態(tài)性之間的交互作用值得關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性與飲酒之間存在相乘交互作用。攜帶Pro等位基因的飲酒者與攜帶Arg／Arg＋Arg／Pro基因的不飲酒者相比，口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)提高11.406倍。這表明Pro基因型可調(diào)節(jié)飲酒的致癌作用，如果兩個(gè)因素同時(shí)暴露，使患口腔癌的危險(xiǎn)性增加。本結(jié)果與Ihsan等研究結(jié)果一致[16]。飲酒是口腔癌重要危險(xiǎn)因素之一，酒中可能包含一些致癌物質(zhì)或產(chǎn)生一些致癌物，或可阻礙致癌物的降解，在致癌過程中，由于P53Pro等位基因的存在，使p53抑癌功能發(fā)生變化，細(xì)胞惡性生長，導(dǎo)致患口腔癌危險(xiǎn)性升高。但本次研究未發(fā)現(xiàn)它們之間存在相加交互作用。

此外，P53Pro等位基因與吸煙之間的相乘交互作用雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但研究中發(fā)現(xiàn)，與攜帶Arg／Arg基因的不吸煙者相比，攜帶Pro／Pro基因型的吸煙者患口腔癌的OR值為7.672（3.567，16.503），提示P53Pro等位基因在一定程度上調(diào)節(jié)并增強(qiáng)吸煙的致癌作用。有研究顯示，重度吸煙者的口腔黏膜細(xì)胞DNA損傷明顯高于非吸煙者，頭頸部鱗癌患者p53基因過度表達(dá)和缺失與患者吸煙有關(guān)，煙草中的致癌物會(huì)誘發(fā)p53基因發(fā)生的突變和失活[17]。目前p53基因多態(tài)性與吸煙的交互作用在口腔癌中研究還很少，但p53多態(tài)性與吸煙的交互作用在其他癌癥研究中均有交互作用的報(bào)道，如p53基因型與肝癌的研究已有報(bào)道，攜帶Pro等位基因可提高乙肝病毒攜帶者患肝癌的危險(xiǎn)性[18]；又如一些對(duì)肺癌的研究則表明，Pro等位基因可提高吸煙者患肺癌的危險(xiǎn)性[19－20]；還有在前列腺癌的相關(guān)研究中也提示，Pro等位基因可提高吸煙者患癌的危險(xiǎn)性[21]。因此，p53基因多態(tài)性所決定的遺傳易感性可調(diào)節(jié)在吸煙暴露下對(duì)不同癌癥發(fā)病的影響。P53Pro等位基因與吸煙聯(lián)合作用，在一定程度上可導(dǎo)致口腔癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上所述，p53基因Pro／Pro基因型可能是福建地區(qū)口腔癌的易感基因，飲酒與p53第4外顯子72密碼子多態(tài)性位點(diǎn)之間有相乘交互作用。遺傳因素?zé)o法改變，因此，提倡健康的生活方式對(duì)預(yù)防口腔癌有重要的意義。本次研究僅針對(duì)福建地區(qū)的人群，還需要擴(kuò)大樣本量和地區(qū)范圍開展更深入的研究，進(jìn)一步探討遺傳因素與生活方式在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用。

（致謝：衷心感謝福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科林李嵩主任、林耿冰副主任醫(yī)師、饒振雄醫(yī)師、廖云陽醫(yī)師、鄭曉燕護(hù)士在現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查中的大力支持，感謝福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院黃江峰、葉珍妹、葉貴華、葉佳增在實(shí)驗(yàn)過程中的辛勤付出。）

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