抗Ⅶ型膠原抗體ELISA輔助確診一例獲得性大皰性表皮松解癥及文獻復習

李志量 王光平 佘曉東 李筱芳 王寶璽 馮素英

抗Ⅶ型膠原抗體ELISA輔助確診一例獲得性大皰性表皮松解癥及文獻復習

李志量 王光平 佘曉東 李筱芳 王寶璽 馮素英

目的報道抗Ⅶ型膠原抗體酶聯免疫吸附實驗(ELISA)輔助確診1例獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)。同時復習文獻,分析在大樣本中該方法診斷EBA的敏感性和特異性。方法對1例臨床表現、組織學特點、免疫學特點符合EBA的患者,應用抗Ⅶ型膠原抗體ELISA試劑盒檢測其血清中Ⅶ型膠原抗體滴度;以4例健康人、5例大皰性類天皰瘡和3例尋常型天皰瘡患者為對照。查閱既往關于ELISA法診斷EBA的文獻,總結各研究中患者入組標準、包被的抗原、敏感性、特異性,并與其他血清學方法對比。結果ELISA法檢測該患者血清中抗Ⅶ型膠原抗體滴度為136 U/ml,對照組均為陰性。既往文獻中,敏感性和特異性有區別,但總體而言,ELISA法診斷EBA的準確性高于免疫印跡。結論ELISA法診斷EBA簡單快捷,具有較高準確性。

表皮松解,大皰性,獲得性;酶聯免疫吸附測定

獲得性大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa acquisita,EBA)是一種以血清中出現Ⅶ型膠原抗體為特點的自身免疫性水皰病。該病通過臨床表現、組織學及直接免疫熒光檢查很難與其他表皮下水皰病鑒別。目前國內確診該病主要依賴鹽裂正常皮膚為底物的間接免疫熒光檢查(salt-split indirect immunofluorescence，SSIIF)和免疫印跡檢查。即使SSIIF在真皮側發現抗體沉積,仍無法將EBA與P200類天皰瘡及部分瘢痕性類天皰瘡鑒別。免疫印跡檢查操作繁瑣,限制了其在臨床的應用。我們在國內首次用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確診了1例EBA患者。

病歷資料

患者男,31歲,半年前無明顯誘因于雙脛前出現散在紅斑,伴有瘙癢,隨后出現黃豆至蠶豆大水皰,皰壁緊張,不易破,水皰逐漸累及至整個下肢、上肢、軀干,當地醫院診斷為大皰性類天皰瘡,給與甲潑尼龍60 mg/d口服,皮損控制后逐漸減量。減至35 mg/d時大皰再次泛發全身,來我院就診。發病以來精神、睡眠尚可,大小便無明顯異常。家庭中無類似疾病患者,發現乙肝表面抗原攜帶2個月。

體檢:一般情況可,生命體征正常。全身淺表淋巴結未觸及腫大。心肺腹部檢查未見特殊。皮膚科情況:頭皮、頸部、軀干、四肢密集分布米粒至雞蛋大小紅斑,前胸、后背散在蠶豆大糜爛面,結褐色痂(圖1)。雙手前臂可見粟丘疹。

皮損組織病理學檢查:表皮下水皰形成,皰內可見纖維蛋白樣物質及少許嗜酸性粒細胞,真皮淺層血管周圍可見淋巴細胞及少許嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤(圖2)。直接免疫熒光示IgG、C3基底膜帶線狀沉積。

實驗室及輔助檢查:血尿糞常規正常;肝腎功能、電解質正常;免疫球蛋白及補體均正常,可提取核抗原及抗核抗體均陰性,乳酸脫氫酶、血細胞沉降率及C反應蛋白均正常,結核菌素純蛋白衍生物實驗陰性;乙肝表面抗原、e抗原、核心抗體陽性。腫瘤標記物檢查均陰性,心電圖正常;腹部B超檢查示肝脂肪浸潤。SSIIF檢查示患者血清IgG抗體在真皮側沉積(圖3);Ⅶ型膠原抗體ELISA(日本MBL，Nagoya公司)檢測患者血清中抗體滴度為136 U/ml(參考值＜6 U/ml)。同時用該試劑盒檢測4例健康人、5例大皰性類天皰瘡患者、3例尋常型天皰瘡患者血清,結果均為陰性。

診斷:獲得性大皰性表皮松解癥。

治療:考慮到該患者乙肝病毒處于活動期,為避免長期應用糖皮質激素引起病毒的進一步增殖,除給予甲潑尼龍40 mg/d靜脈滴注外,還應用靜脈注射免疫球蛋白(IVIg)2 g/kg分5天靜脈泵入,口服四環素0.25 g日3次,煙酰胺0.9 g日3次,半個月后皮疹控制,甲潑尼龍逐漸減量。電話隨訪4個月,皮疹未復發。

討 論

Ⅶ型膠原是位于致密板和致密板下帶錨絲的主要成分。EBA患者血清中自身抗體針對的抗原表位主要位于Ⅶ型膠原的NC1域內［1］。針對NC1最末端227個氨基酸的軟骨基質蛋白的血清抗體被證實具有致病性［2］。部分EBA患者血清中也可以檢測到針對 NC2 域［3］和中間膠原區［4］的自身抗體,這類抗體的致病性及與EBA臨床表現的關系尚待研究。

通過臨床表現和組織病理學檢查往往難以把EBA與大皰性類天皰瘡、瘢痕性類天皰瘡、線狀IgA大皰性皮病、P200類天皰瘡等其他表皮下水皰病鑒別開來,因此血清學檢查有不可替代的作用。常用的血清學檢測方法主要有三種:間接免疫熒光(IIF)、免疫印跡和ELISA。IIF僅能將線狀IgA大皰性皮病與其他表皮下大皰病鑒別,即使進一步行SSIIF檢查也僅能確診大皰性類天皰瘡,其他表皮下水皰病均表現為真皮側抗體沉積。進一步行免疫印跡檢查,理論上EBA患者血清抗體可以與真皮蛋白抗原在相對分子質量290 000處結合,但部分EBA血清中抗Ⅶ型膠原抗體是與Ⅶ型膠原NC1域的構象表位結合,在免疫印跡過程中這種構象表位受到破壞,會出現假陰性。

1997年,Chen等［5］首次以真核表達的具有完整空間構象的Ⅶ型膠原NC1段為底物對EBA患者血清進行ELISA檢測,發現該方法具有極高的敏感性和特異性,可以檢測到IIF和免疫印跡均陰性的患者血清中的抗體。隨后多種包被不同抗原底物的ELISA檢測方法以及商品化的Ⅶ型膠原抗體檢測試劑盒都證實了該方法的可靠性［2，6-13］;由于既往研究選擇的入組患者和包被抗原底物的不同,ELISA檢測的敏感性和特異性有一定差異,但總體而言該方法的準確性要優于免疫印跡(表1)。我們在本文中所用的商品化試劑盒除包被了NC1段外,也包被了NC2段,理論上可以進一步提高敏感性。也有研究表明,ELISA法檢測到的抗體滴度與病情活動具有相關性,可用于臨床指導治療［5-7，9，11，13-15］。

圖1 患者背部散在紅斑,部分皮疹結痂、破潰

圖2 皮損組織病理檢查見表皮下皰,真皮淺層見炎細胞浸潤(HE×40)

圖3 鹽裂正常皮膚為底物的間接免疫熒光檢查示,患者血清IgG抗體沉積在鹽裂皮膚真皮側(×40)

表1 既往應用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)診斷獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)的敏感度、特異度及與其他血清學方法的比較

ELISA法簡便、快捷和無創的特點對EBA的診斷具有較高的應用價值。我們報道的這例患者,在沒有進行免疫印跡檢測的前提下,直接用ELISA方法確診,說明該方法對EBA具有診斷價值。特別在現有技術條件下,大多數醫療機構無法常規開展SSIIF和免疫印跡這些步驟繁瑣、技術要求高的檢測方法,將Ⅶ型抗體檢測試劑盒與BP180 NC16A抗體檢測試劑盒結合起來,可以有效提高表皮下水皰病的診斷準確率。

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Detection of anti-type Ⅶ collagen antibodies using enzyme-linked immunosorbent assay in the auxiliary diagnosis of epidermolysis bullosa acquisita:a case report and literature review

Li Zhiliang，Wang Guangping，She Xiaodong，Li Xiaofang，Wang Baoxi，Feng Suying.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs，Hospital of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Wang Baoxi，Email:wangbx@ncstdlc.org；Feng Suying，Email:fengsuying2010@aliyun.com

Objective To evaluate the performance of anti-type Ⅶ collagen antibody detection using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)in the auxiliary diagnosis of a case of epidermolysis bullosa acquisita(EBA)，and to analyze its sensitivity and specificity for the diagnosis of EBA in large-scale studies by review of relevant literature.Methods Serum samples were collected from a patient with typical clinical，histological and immunological manifestations of EBA，4 healthy human controls，5 patients with bullous pemphigoid and 3 patients with pemphigus vulgaris.ELISA was performed to determine the serum levels of anti-typeⅦcollagen antibodies.Literature regarding the diagnosis of EBA using ELISA was reviewed with a summary of inclusion criteria for patient enrollment，coating antigens，sensitivity and specificity.A comparison was carried out between ELISA and the other serological methods.Results Anti-typeⅦcollagen antibodies were detected by ELISA in the serum of the patient with EBA(136 U/ml)，but not in the other serum samples.The sensitivity and specificity of ELISA in the diagnosis of EBA differed in different studies，but in general，the accuracy of ELISA was higher than that of immunoblotting.Conclusion ELISA is a simple and convenient tool for the diagnosis of EBA with high accuracy.

Epidermolysis bullosa acquisita；Enzyme-linked immunosorbent assay

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.004

衛生公益性行業科研專項經費(201002016)

210042南京,中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院,江蘇省皮膚病與性病學重點實驗室

王寶璽,Email:wangbx@ncstdlc.org;馮素英,Email:fengsuying2010@aliyun.com

2013-12-26)

(本文編輯:顏艷)