家族性原發性皮膚淀粉樣變一家系的OSMR基因突變檢測

周云 曹先偉 許桂文 吳紅宣 郭竹秀 陳麗

家族性原發性皮膚淀粉樣變一家系的OSMR基因突變檢測

周云 曹先偉 許桂文 吳紅宣 郭竹秀 陳麗

目的檢測家族性原發性皮膚淀粉樣變一家系患者的OSMR基因突變情況。方法收集一家族性皮膚淀粉樣變家系臨床資料,提取先證者及其19名相關親屬、50例無關健康對照外周血DNA,采用PCR擴增OSMR基因編碼區的全部外顯子及其側翼序列并測序。結果基因檢測發現,先證者OSMR基因發生c.2081C＞T雜合突變,導致氨基酸出現p.P694L改變,家族中其他患者均發現同樣突變位點,而家族健康成員及健康對照組均未檢出此突變。結論OSMR基因的p.P694L突變可能是導致患者出現皮膚淀粉樣變臨床表型的病因。

淀粉樣變,家族性;OSMR基因;突變,誤義

皮膚淀粉樣變(PCA)是一種慢性瘙癢性皮膚病,大多數為散發病例,約10%有顯性遺傳家族史［1］。家族性原發性皮膚淀粉樣變(FPCA,OMIM 105250)一般在青春期前后起病,通常表現為脛前瘙癢,可見色素沉著及皮膚增厚或苔蘚樣變,可逐漸向身體其他部位蔓延,皮損可因慢性搔抓和摩擦等慢性損傷而加重。目前認為FPCA的發病為第5號染色體上編碼細胞因子制瘤素M 特異性受體 β(oncostatin M-specific receptor β,OSMRβ)的基因OSMR突變所致［1］。我們對一個FPCA家系進行OSMR基因突變檢測。

一、檢測對象

先證者(Ⅲ13)男,46歲,18歲時雙脛前對稱散在米粒大小褐色斑丘疹,后逐漸形成隆起的丘疹,伴有明顯瘙癢感。丘疹逐漸增大并增多,針頭至米粒大小,呈多角形或不規則形,棕褐色,密集成片但不融合,周邊可見少許褐色斑疹。皮損處皮膚較干燥且粗糙,表面可見少許鱗屑,有較多黑色角栓,伴有抓痕和血痂。家族中其他受累成員發病年齡為5～25歲(圖1),主要表現為皮膚苔蘚樣變,亦可見斑狀皮損。典型表現為開始于小腿的少量輕度苔蘚樣變丘疹伴輕微色素沉著,家系中大部分患者逐漸發展為局限于小腿的不同程度的以苔蘚樣變為主的皮損,并伴有不同程度的瘙癢(圖2a)。對照組50例為與此家系無血緣關系且無皮膚淀粉樣變的健康人。

圖1 原發性皮膚淀粉樣變家圖 *:采血并做了基因檢測

二、方法

1.組織病理學檢查:取先證者脛前丘疹性皮損行HE染色和剛果紅染色。

2.DNA提取:分別抽取先證者、19例家庭成員及50例健康對照外周血2 ml,2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,以低滲溶血以及酚-氯仿抽提法提取DNA。

3.PCR引物設計:根據OSMR基因序列(來源于http://www.ensembl.org/index.html),利用 Primer3在線版(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計18對特異性引物擴增先證者OSMR基因編碼區18個外顯子及其側翼序列,引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

圖2 原發性皮膚淀粉樣變的臨床及病理特征 2a:患者脛前多角形丘疹,棕褐色,密集成片但不融合,表面可見少許鱗屑、皮膚粗糙干燥,頂端多見黑色角栓;2b:剛果紅染色顯示真皮乳頭層無定形的陽性團塊(×40)

圖3 原發性皮膚淀粉樣變患者基因測序結果 3a:先證者c.2081C＞T雜合突變測序圖,家族中其他患者測序結果與先證者相同;3b:家系中未受累成員及50例健康對照的該位點測序圖

4.PCR反應體系及條件:PCR反應體系25 μl,含基因組DNA 50 ng,dNTPs 0.4 mmol/L,MgCl22.0 mmol/L,上下游引物各10 μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 U。反應條件:95℃預變性5 min后,進行以下10個循環:94℃變性30 s,62℃退火30 s(每個循環后退火溫度降低0.5℃),72℃延伸45 s,接著進行35個循環:94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s,共45個循環,最后72℃延伸9 min,DNA擴增在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR擴增儀上進行。所有PCR產物純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司測序。

三、結果

HE染色示表皮輕度角化過度,棘層肥厚,真皮乳頭層內見大小不一的團塊狀嗜伊紅性淀粉樣物質沉積,剛果紅染色陽性(圖2b)。以先證者基因組DNA為模板,所有18對引物在各自的條件下分別擴增出各自產物,包括所有外顯子的編碼序列以及兩端至少60 bp的側翼序列。所有產物純化后測序結果與Ensembl網站所公布的序列進行對照發現,先證者OSMR基因15號外顯子第2 081位核苷酸(從cDNA編碼起始位點ATG算起)發生C→T雜合錯義突變(c.2081C＞T),見圖3a。導致第694號編碼氨基酸發生脯氨酸到亮氨酸(p.P694L)改變,突變來自母親。先證者母親及其他受累親屬均發生同樣突變,而未受累成員及50例健康對照均未見該突變(圖3b)。

四、討論

FPCA是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病。2006 年,Lee 等［2］應用全基因組掃描等方法將FPCA的致病基因定位于 5p13.1-q11.2。 2008 年,Arita 等［1］應用微衛星連鎖分析法確定本病的致病基因為OSMR。OSMR基因編碼的跨膜蛋白OSMRβ是制瘤素M Ⅱ型受體［3］和白介素31受體［4］的重要組成部分,OSMRβ和gp130結合組成制瘤素MⅡ型受體,OSMRβ與IL31RA結合組成白介素31受體,這兩種受體均屬于IL-6細胞因子受體家族成員［3］。位于OSMRβ分子上的Ⅲ型纖連蛋白(FNⅢ)結構對OSMRβ與其相應受體亞單位的二聚化過程起到重要的作用［5］。本研究報道的突變氨基酸p.P694L位于 OSMRβ 分子上的 FNⅢ重復區域［6］。 Lin 等［6］通過對 29 個FPCA家系的基因研究發現,其中一個家系的IL31RA基因發生雜合錯義突變(c.1562C＞T),導致氨基酸發生p.S521F改變,可能也與本病發生有關。IL31RA基因也位于5號染色體,其編碼的IL31RA與OSMRβ結合形成IL-31受體。Lin等［6］推測此突變也是通過影響皮膚相應的信號通路而引起FPCA的發生。

［1］Arita K，South AP，Hans-Filho G，et al.Oncostatin M receptorbeta mutations underlie familial primary localized cutaneous amyloidosis［J］.Am J Hum Genet，2008，82(1):73-80.

［2］Lee DD，Lin MW，Chen IC，et al.Genome-wide scan identifies a susceptibility locus for familial primary cutaneous amyloidosis on chromosome 5p13.1-q11.2 ［J］.Br J Dermatol，2006，155(6):1201-1208.

［3］Heinrich PC，Behrmann I，Haan S，et al.Principles of interleukin(IL)-6-type cytokine signalling and its regulation［J］.Biochem J，2003，374(Pt 1):1-20.

［4］Hofstra RM，Sijmons RH，Stelwagen T，et al.RET mutation screening in familial cutaneous lichen amyloidosis and in skin amyloidosis associated with multiple endocrine neoplasia［J］.J Invest Dermatol，1996，107(2):215-218.

［5］Kurth I，Horsten U，Pflanz S，et al.Importance of the membraneproximal extracellular domains for activation ofthesignal transducer glycoprotein 130［J］.J Immunol，2000，164(1):273-282.

［6］Lin MW，Lee DD，Liu TT，et al.Novel IL31RA gene mutation and ancestral OSMR mutant allele in familial primary cutaneous amyloidosis［J］.Eur J Hum Genet，2009，18(1):26-32.

Mutation analysis of the OSMR gene in a family with familial primary cutaneous amyloidosis

Zhou Yun*，Cao Xianwei，Xu Guiwen，Wu Hongxuan，Guo Zhuxiu，Chen Li.*Department of Dermatology，First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

Cao Xianwei，Email:ndyfyygk@163.com

Objective To identify mutations in the OSMR gene in a pedigree with familial primary cutaneous amyloidosis(FPCA).Methods Clinical data were collected from a pedigree with FPCA.Peripheral blood samples were obtained from the proband，his 19 relatives，and 50 unrelated healthy human controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples，and subjected to PCR for the amplification of 18 encoding exons and their flanking sequences of the OSMR gene followed by DNA sequencing.Results A heterozygous missense mutation c.2081C ＞ T，which leads to the substitution of proline by threonine at position 694，was detected in the OSMR gene of the proband and his affected relatives，but not in unaffected relatives or healthy controls.Conclusion The heterozygous mutation p.P694L in the OSMR gene may cause the clinical phenotype of FPCA in this family.

Amyloidosis，familial；Gene，OSMR；Mutation，missense

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.017

330006南昌大學第一附屬醫院皮膚科(周云、曹先偉、吳紅宣、郭竹秀、陳麗);青島大學醫學院附屬醫院皮膚科(許桂文)

曹先偉,Email:ndyfyygk@163.com

2013-07-24)

(本文編輯:尚淑賢)