生殖支原體對大環內酯類抗生素耐藥突變位點研究

劉排 蔣娟 張津萍 尢永燕 沙仲 孫厚華 龔匡隆 孫建方

生殖支原體對大環內酯類抗生素耐藥突變位點研究

劉排 蔣娟 張津萍 尢永燕 沙仲 孫厚華 龔匡隆 孫建方

目的了解生殖支原體對大環內酯類抗生素耐藥相關的23S rRNA基因突變情況。方法就診于我院性病門診的91例近期應用過大環內酯類藥物治療的持續性和復發性尿道炎患者,取尿道拭子和前段尿標本進行生殖支原體(Mg)、沙眼衣原體(Ct)、解脲脲原體(Uu)等病原體檢測,篩選出單一生殖支原體陽性患者標本,應用套式PCR擴增與大環內酯類抗生素耐藥性相關的23S rRNA基因V區片段,擴增產物進行DNA測序,測得序列與美國國立生物信息中心已登記的生殖支原體標準株G37的相應基因序列比對。結果91例的標本中,Mg陽性21例,Ct陽性18例(19.8%),Uu陽性10例,Mg與UU同時陽性2例,Ct與Uu同時陽性3例,Mg、Ct和Uu檢測均為陰性者37例。21例Mg陽性標本中,18例的標本成功擴增出23S rRNA基因V區片段,除1例未發現基因突變外,其余17例均發現2058和2059位點突變,其中A2059G突變10例,A2058G突變5例,A2058T突變2例。結論23S rRNA基因V區片段基因突變可能與南京及周邊地區Mg對大環內酯類藥物耐藥性相關。

支原體,生殖器;抗藥性,細菌;抗菌藥

生殖支原體(Mycoplasma genitalium，Mg)是男性非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)的重要病因之一,特別是在男性非衣原體非淋菌性尿道炎中Mg的患病率更高［1］。目前,國外性傳播疾病(STD)治療指南推薦大環內酯類抗生素作為治療Mg陽性NGU的一線方案［2］,但對其耐藥的Mg菌株已經在澳大利亞、瑞典和挪威的患者中分離出來［3-4］。研究發現,與大環內酯類抗生素耐藥性相關的基因突變位于23S rRNA基因V區。本研究對就診于我院性病科門診Mg陽性的男性NGU患者Mg進行耐藥相關突變位點檢測。

對象與方法

一、對象

2012年4-9月就診于中國醫學科學院皮膚病醫院性病科門診的男性NGU患者。入選標準:①年齡滿18周歲;②近2個月內具有持續性或復發性尿道炎史;③近1個月內曾使用大環內酯類抗生素(阿奇霉素、克拉霉素或羅紅霉素);④首次接受治療至本次就診期間無性生活;⑤就診時具有尿痛、尿路不適、排尿困難、尿道分泌物等尿道炎癥狀;⑥尿道拭子涂片革蘭染色鏡檢多形核白細胞計數(PMNL)≥5/每油鏡視野;⑦無前列腺炎史(無典型臨床癥狀或實驗室證據)。排除標準:①尿道拭子涂片或培養淋球菌陽性者;②HIV感染者。

二、方法

1.抽樣與標本采集:本研究通過中國醫學科學院皮膚病醫院倫理委員會審查同意。采用方便抽樣方法入選研究對象,所有研究對象簽署知情同意書后進行體檢和標本采集。每例患者采集3根尿道拭子和10 ml前段尿。第1根拭子用于革蘭染色涂片、中性粒細胞計數及排除淋球菌性尿道炎;第2根拭子立即接種于解脲脲原體液體培養基用于檢測解脲脲原體(Uu);第3根拭子立即凍存于-20℃,供沙眼衣原體(Ct)熒光定量PCR之用。前段尿標本立即凍存于-70℃,供生殖支原體PCR檢測之用。

2.主要試劑與儀器:淋球菌培養基(珠海迪爾生物工程有限公司)、解脲脲原體液體培養基(法國BioMerieux公司)、沙眼衣原體核酸檢測試劑盒(廣州中山大學達安基因股份有限公司)。PCR反應酶GoTaq? Green Master Mix(美國Promega公司)、GeneAmp 9700 PCR儀(美國ABI公司)、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

3.淋球菌、沙眼衣原體及解脲脲原體檢測:檢測操作流程嚴格按照檢測試劑盒說明書進行。

4.生殖支原體檢測:DNA提取采用Chelex-100樹脂(美國Oxide公司)法,按照文獻［5］方法進行。生殖支原體檢測采用套式PCR方法,按照文獻［6］進行。陽性擴增產物純化后全部送上海英駿生物技術有限公司進行雙向測序,并將測序結果與Genbank中的提交序列進行BLAST比對。

5.生殖支原體23S rRNA基因V區片段擴增:Mg陽性標本中Mg 23S rRNA基因V區片段擴增采用套式PCR方法,外套引物為Mg23S-1986f(5'-GTGTAACCATCTCTTGACTGTCTCGG-3')和Mg23S-2171r(5'-TTCACATCAACAAATCCTTGCGA-3'),內套引物為Mg23S-1992F(5'-CCATCTCTTGACTGTC TCGGCTAT-3')和Mg23S-2138R(5'-CCTACCTATT CTCTACATGGTGGTGTT-3')。外套PCR反應體系:5 μl模板加入20 μl反應液(其中包括上下游引物各 0.5 μmol/L,dNTP 各 200 μmol/L,Taq DNA 聚合酶1 U)中。外套PCR循環:95℃預變性2 min,然后按95℃45 s,58℃60 s,72℃60 s共35個循環,最后72℃延長5 min。外套擴增產物用超純水稀釋10倍,取1 μl作為內套模板,加入50 μl反應液。內套PCR循環:95℃預變性2 min,然后按95℃45 s,55℃ 30 s,72℃30 s共35個循環,最后72℃延長5 min。套式PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L EB)電泳,凝膠成像觀察并記錄結果。擴增產物預期片段為147 bp。陽性擴增產物純化后全部送上海英駿生物技術有限公司進行雙向測序。將測序結果與Genbank中的提交序列進行BLAST比對。

結 果

一、人口學資料和STD病史

共調查門診尿道炎患者264例,91例符合入選標準。年齡18～69歲,平均年齡37.0歲。尿道炎病程7～60 d,平均20.2 d。曾使用過一種大環內酯類抗生素(阿奇霉素、克拉霉素或羅紅霉素)治療的有37例(40.7%),曾使用過兩種及以上大環內酯類抗生素治療的有54例(59.3%)。

二、STD檢測結果

所有91例均提供標本進行病原體檢測,54例(59.3%)檢測到至少1種病原體,其中Mg 21例(23.1%),Ct 18例(19.8%),Uu 10例(11.0%),Mg+Uu 2例(2.2%),Ct+Uu 3例(3.3%),Mg、Ct、Uu均陰性37例(40.7%),無Mg+Ct及Mg+Ct+Uu病例。

三、Mg 23S rRNA基因V區片段擴增結果

21例Mg陽性標本進行23S rRNA基因V區片段擴增,其中18例成功擴增出目的基因片段,獲得147 bp大小片段,見圖1。

四、Mg 23S rRNA基因V區片段擴增產物測序和比對結果

18例Mg陽性標本擴增產物測序結果與GenBank中的提交序列進行BLAST比對后發現,除1例未發現23S rRNA基因核苷酸點突變外,其余17例均存在23S rRNA基因核苷酸點突變,其中A2059G突變10例,A2058G突變5例,A2058T突變2例。測序峰圖見圖2～5。

討 論

Mg是近年來逐漸被人們所認識到一種病原體,許多研究證明,Mg是男性NGU的重要病因［7-8］。由于Mg缺乏細胞壁,作用于細胞壁的抗生素,如青霉素類,對其無效。臨床上多采用干擾蛋白質合成的藥物如大環內酯類藥物,以及干擾DNA復制的藥物如喹諾酮類藥物治療Mg感染。研究表明,阿奇霉素5 d療法(首日500 mg,第2～5天250 mg/d)對Mg感染患者的清除率較高。因此,國外STD治療指南將大環內酯類藥物作為目前治療Mg感染的一線方案。

然而隨著大環內酯類藥物廣泛應用于治療Mg感染,近年來關于其耐藥的報道也越來越多。Bradshaw等［3］采用阿奇霉素1 g頓服方案、或者1 g每周1次口服共3次的方案治療Mg陽性的男性NGU患者,發現高達28%的患者Mg持續陽性,分離治療失敗患者體內的臨床株進行體外藥敏試驗,結果發現,對阿奇霉素的最低抑菌濃度(MIC)升高,提示其對阿奇霉素的敏感性降低。最近的幾項研究中［9-10］,阿奇霉素1 g單劑量療法對患者Mg感染的清除率僅為67%～84%,這一現象可能反映了人群中已經存在對大環內酯類抗生素具有耐藥性的Mg,也可能反映了阿奇霉素誘導Mg對大環內酯類抗生素耐藥性的出現。

圖1 生殖支原體23S rRNA基因V區片段擴增產物電泳圖1:100 bp DNA標準參照物;2、3:生殖支原體臨床陽性標本,147 bp;4:G37標準株,147 bp;5:陰性對照(ddH2O),無擴增

圖2 生殖支原體G37標準株23S rRNA基因V區片段序列峰圖

圖3 A2059G突變生殖支原體臨床株23S rRNA基因V區片段序列峰圖

圖4 A2058G突變生殖支原體臨床株23S rRNA基因V區片段序列峰圖

圖5 A2058T突變生殖支原體臨床株23S rRNA基因V區片段序列峰圖

細菌對大環內酯類藥物的耐藥機制包括靶位點突變、靶位甲基化修飾、主動外排機制、核糖體蛋白突變和鈍化酶等。目前研究發現,支原體對大環內酯類藥物的耐藥機制主要為基因突變導致的靶位點改變,這些研究主要集中在肺炎支原體和解脲支原體［11-12］。這些研究發現,對大環內酯類藥物耐藥突變位點主要位于23S rRNA基因和核糖體蛋白基因L4和L22基因。目前關于生殖支原體對大環內酯類藥物耐藥機制的研究較少。Jensen等［4］對7株從阿奇霉素治療失敗的男性Mg相關尿道炎的患者體內獲得的菌株進行體外大環內酯類抗生素的藥物敏感試驗,研究Mg對大環內酯類抗生素的耐藥分子機制。研究發現,Mg23S rRNA V區位于2 058和2 059位點的點突變與Mg對阿奇霉素的耐藥性相關。耐藥性導致非劑量依賴性的大環內酯類抗生素治療失敗,而且耐藥性可能是由于阿奇霉素單劑量頓服治療方案的不足量誘導的。研究者認為,Mg對阿奇霉素耐藥性主要是由于在沒有弄清NGU的真正病原菌前提下給予阿奇霉素單劑量治療所誘導的。盡管在其他柔膜細菌中發現L4和L22基因區突變位點與大環內酯類抗生素耐藥性相關,該研究發現L4基因許多點突變發生,但是大多數并不導致氨基酸改變,因此不能解釋與耐藥相關。近來,新西蘭和日本學者的研究［13-15］也發現,23S rRNA基因A2059G突變與Mg對大環內酯類抗生素的耐藥性相關。同時,通過對治療前后尿液標本中Mg進行基因分型發現,發生耐藥基因突變的Mg菌株都是來自于治療前未發生耐藥基因突變的高度相近的或完全相同的菌株,是經過阿奇霉素治療選擇而來。因此,23S rRNA基因位點突變可能是介導Mg對大環內酯類藥物耐藥性的主要機制,阿奇霉素單劑量治療方案可能會誘導Mg對大環內脂類抗生素耐藥性的產生。

本研究對91例持續性和復發性NGU患者病原體進行檢測發現,除37例(40.7%)未檢測到病原體外,Mg感染(25.3%)和Ct感染(23.1%)是最常見的病原菌。Mg、Ct和Uu檢測均陰性的患者可能是由于神經精神因素、變態反應因素等非感染性因素引起,也可能是由于陰道毛滴蟲、單純皰疹病毒或其他臨床少見病原體感染所致［16-17］。

本研究91例患者均為近期接受大環內酯類抗生素治療失敗的患者,且患者自接受治療至本次就診期間無性生活,排除了治療后再感染的可能。因此,標本檢測Mg陽性可能是由于其對大環內酯類藥物耐藥所致。本研究21例Mg陽性標本中,18例成功擴增出目的基因片段,除1例未發現基因突變外,其余17例均存在23S rRNA基因核苷酸點突變。與既往國外研究結果類似,本研究中耐藥基因突變位點位于2058和2059位點,其中A2059G突變10例,A2058G突變5例,A2058T突變2例,未發現其他位點的突變,提示引起南京及周邊地區STD門診Mg耐藥的主要機制可能是23S rRNA基因V區的點突變,2059位點突變占主導位置。A2058T突變為本研究首次發現,其在Mg對大環內酯類藥物耐藥性中的具體作用有待于進一步研究證實。既往有研究報道,Mg耐藥可能與核糖體蛋白L4和 L22 基因突變相關［4，14-15］,但是其突變與 A2058G或A2059G同時發生,不足以證明與大環內酯類耐藥性相關。同時,肺炎支原體耐藥性研究發現,與23S rRNA基因V區突變相比,L4和L22突變僅可能與低水平耐藥相關。因此,本研究未對L4和L22基因位點突變進行研究。

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Detection of point mutations associated with macrolide resistance inMycoplasma genitalium

Liu Pai，Jiang Juan，Zhang Jinping，You Yongyan，Sha Zhong，Sun Houhua，Gong Kuanglong，Sun Jianfang.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Jiang Juan，Email:drjjiang@vip.163.com；Sun Jianfang，Email:sunjf57@163.com

Objective To detect point mutations associated with macrolide resistance in the 23S rRNA gene ofM.genitalium.Methods Ninty-one patients with persistent or recurrent urethritis，who had been treated with macrolides in the past one month but achieved no obvious improvement，were included in this study.Urethral swab and first-void urine samples were collected from these patients.Gram's staining，culture and fluorescence-based quantitative PCR were carried out to detectNeisseria gonorrhoeae，Ureaplasma urealyticumandChlamydia trachomatisrespectively in these urethral swab samples，and PCR was performed to detectM.genitaliumin the urine samples.For patients positive to onlyM.genitalium，nested PCR was conducted to amplify the domain V of the 23S rRNA gene followed by direct automatic sequencing，and the resulting sequences were compared to the corresponding sequences ofM.genitaliumG37 strain submitted to the National Center for Biotechnology Information.Results Of the 91 patients，21 were positive forM.genitalium，18 forC.trachomatis，10 forU.urealyticum，2 for bothM.genitaliumandU.urealyticum，3 for bothC.trachomatisandU.urealyticum，and 37 for none of the tested pathogens.The domain V of the 23S rRNA gene，which was amplified from 18 of the 21M.genitalium-positive samples，carried an A to G transition at position 2059 in 10 samples，an A to G transition at position 2058 in 5 samples，an A to T transition at position 2058 in 2 samples，but no point mutations in 1 sample.Conclusion The point mutations in domain V of the 23S rRNA gene may contribute to macrolide resistance inM.genitaliumin Nanjing and its surrounding areas.

Mycoplasma genitalium；Drug resistance，bacterial；Anti-bacterial agents

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.005

210042南京,中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所

蔣娟,Email:drjjiang@vip.163.com;孫建方,Email:sunjf57@163.com

2013-11-13)

(本文編輯:顏艷)