廣西地區漢族嬰幼兒脈管性疾病與HLA-DRB1等位基因相關性研究

韋妮波 陳深 嚴煜林

廣西地區漢族嬰幼兒脈管性疾病與HLA-DRB1等位基因相關性研究

韋妮波 陳深 嚴煜林

目的探討廣西地區漢族嬰幼兒脈管性疾病與HLA-DRB1等位基因遺傳易感性的關系。方法廣西地區漢族嬰幼兒脈管性疾病145例(血管瘤組99例、脈管畸形組46例),健康對照組105例。采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)方法對3組HLA-DRB1等位基因進行分型,使用SPSS16.0統計軟件分析DRB1基因在3個組中的分布。結果DRB1*0901、*1401、*16等位基因在血管瘤組、脈管畸形組、對照組的分布差異均有統計學意義(χ2=13.05,P＜0.01;χ2=12.79,P＜0.01;χ2=10.36,P＜0.01)。進一步在各組間進行兩兩比較,DRB1*0901等位基因頻率在血管瘤組與脈管畸形組間(RR=4.84,P＜0.01)及血管瘤組與對照組組間(RR=3.21,P＜0.01)差異均有統計學意義。DRB1*16等位基因頻率在血管瘤組與對照組組間(RR=2.25,P＜0.01)及脈管畸形組與對照組間(RR=2.60,P＜0.01)差異均有統計學意義。血管瘤組中DRB1*1401等位基因頻率顯著性低于對照組(RR=0.30,P＜0.01)。結論DRB1*0901等位基因可能為廣西地區漢族嬰幼兒血管瘤的易感基因,而DRB1*1401等位基因可能是其拮抗基因。HLA-DRB1*16等位基因可能為廣西地區漢族脈管性疾病的易感基因。

血管瘤;動靜脈畸形;HLA抗原;等位基因

血管瘤和脈管畸形是兩種性質完全不同的病變,其臨床表現、病程和轉歸均不相同,發病機制尚未完全明確。人類白細胞抗原(HLA)基因表達和等位基因突變是腫瘤發展的重要影響因素。本研究旨在探討廣西地區嬰幼兒脈管性疾病與HLA-DRB1等位基因遺傳易感性的關系。

一、對象

2010-2012年在廣西醫科大學第六附屬醫院玉林市人民醫院口腔科、血管瘤專科門診確診的脈管性疾病患者145例,均為漢族,雙親3代均生活在廣西,相互間無血緣關系。依據國際脈管性疾病研究協會公布的ISSVA分類方法［1］,分為血管瘤組99例,脈管畸形組46例。血管瘤組99例中,男33例,女66例,年齡1～3(1.2±0.2)歲。脈管畸形組中男16例,女30例,年齡1～3(1.1±0.3)歲。健康對照組105例,為同期在本院體檢、相互間無血緣關系的健康人,均為漢族,雙親3代均生活在廣西,無血管瘤、血管畸形病史,其中男38例,女67例,年齡1～3(1.3±0.2)歲。3組在性別、年齡比例上均衡可比。

二、主要試劑與儀器

TaqDNA聚合酶、dNTP、Marker1及 HLA-DRB1等位基因序列特異性引物及內對照引物均由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成。Biometra PCR擴增儀為德國Biometra公司產品。凝膠成像及圖像分析系統為英國UVP公司產品。紫外分光光度計為美國Beckman公司產品。

三、方法

1.模板DNA的制備:抽取所有研究對象外周靜脈血3 ml(2%EDTA抗凝),常規酚-氯仿抽提法從白細胞提取基因組DNA,將DNA溶解于100 μl TE緩沖液中,置-20℃冰箱保存待用。

2.HLA-DRB1基因型分析:采用PCR-SSP方法分析HLA-DRB1基因多態性,參照文獻［2］設計并合成17對特異性引物,其所擴增的產物具有相應等位基因的特異性。選用β珠蛋白基因第二內含子一段保守區基因片段作為內參照物,產物大小為578 bp。PCR擴增終體積為25 μl,包括模板DNA 1 μl(濃度0.05～0.1 g/L),上、下游特異性引物各1 μl,內對照引物C、D各1 μl,Mix反應液12.5 μl,滅菌雙蒸水7.5 μl。PCR擴增條件:95℃預變性5 min,94℃變性30 s;56～62℃退火45 s(在梯度PCR儀上找出每對特異性引物的最適退火溫度,退火溫度分別為:58、56、58、58、58、58、58、58、58、58、62、60、58、58、58、60、58 ℃),72 ℃延伸 30 s,72 ℃后延伸5 min,共30個循環。

3.基因型的確定:PCR產物經2%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴化乙錠)電泳,100 V恒壓電泳30 min。將凝膠置于紫外凝膠自動成像儀下觀察并判斷基因型。

四、統計學處理

采用直接計數法計算等位基因頻率,兩組間等位基因頻率的比較采用四格表χ2檢驗,當1≤ T＜5時,采用校正卡方檢驗;當T＜1或有一個格子為0時,采用Fisher確切概率法。三組間等位基因頻率比較采用行×列表χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。以相對危險系數(relative rate，RR)表示有關聯基因人群患病率的倍數,RR=有基因的患者數×無基因的對照組人數/(有基因的對照組人數×無基因的患者數)。同時計算RR的95%可信區間(CI)。全部統計處理均在SPSS16.0統計分析系統上完成。

五、結果

在設計的17對引物中,血管瘤組檢測出13對等位基因,基因頻率范圍為1.01%～48.48%;脈管畸形組檢測出13對等位基因,基因頻率范圍為2.17%～52.17%;對照組中檢測出14對等位基因,基因頻率范圍為1.90%～33.33%。對照組、血管瘤組和脈管畸形組DRB1*0901、*1401、*16等位基因頻率差異均有統計學意義(表1)。進一步在各組間進行兩兩比較,DRB1*0901等位基因頻率在血管瘤組與脈管畸形組間(RR=4.84,P＜0.01)及血管瘤組與對照組間(RR=3.21,P＜0.01),差異均有統計學意義。DRB1*16等位基因頻率在血管瘤組與對照組組間(RR=2.25,P＜0.01)及脈管畸形組與對照組組間(RR=2.60,P＜0.01)差異均有統計學意義。血管瘤組中DRB1*1401等位基因頻率表達顯著低于對照組(RR=0.30,P＜0.01)。其他等位基因頻率在血管瘤組、脈管畸形組與對照組間差異均無統計學意義。見表1。

六、討論

對血管瘤病變家系及散發病例分析發現,基因突變在血管瘤的形成中起作用［3］。有研究證實,毛細血管畸形病例屬常染色體顯性遺傳,顯性基因包括 CMC1、RASA1 和 Del-1［4］。

Verkarre等［5］發現,HLA-DR在血管瘤內皮細胞表達與血管分化呈負相關。秦興軍等［6］發現,HLA-DR在正常皮膚和血管畸形血管內皮細胞呈低表達或不表達,增殖期幾乎不表達,而在退化期卻高表達,提示高分化血管內皮細胞表達HLA-DR可能與內皮細胞成熟表型的獲得及活化狀態有關。Shan等［7］發現,增殖期、消退期血管瘤均表達HLA-G,但正常組織不表達,增殖期HLA-G的表達顯著高于消退期及健康對照組。由此推測,增殖期高表達的HLA-G可導致免疫耐受,從而導致腫瘤細胞逃避免疫監視,進而增殖分化。Sanus等［8］研究發現,腦海綿狀血管畸形與HLA-A1、HLA-A24、HLAA32、HLA-B51、HLA-DR1、HLA-DR4 等基因密切相關。 這些研究結果提示,血管瘤及血管畸形與HLA分子密切相關。

表1 血管瘤組、脈管畸形組與對照組HLA-DRB1等位基因頻率的分布

我們的研究發現,DRB1*0901、*1401、*16等位基因頻率在血管瘤與脈管畸形及對照組中表達差異有統計學意義,血管瘤組中DRB1*0901的基因頻率顯著高于脈管畸形組及對照組,而后兩者組間差異無統計學意義。部分學者研究發現,HLA-DRB1*0901可增加兒童再生障礙性貧血患病風險［9］,Hu等［10］發現,HLA-DRB1*0901與食管磷狀細胞癌密切相關,是食管鱗狀細胞癌的易感基因。我們的結果與國內外學者關于惡性腫瘤的研究結果相一致,提示DRB1*0901可能與良性及惡性腫瘤存在一定相關性。而我們的結果與國內學者關于HLA與良性腫瘤的研究結果不一致,宗利麗等［11］發現,DRB1*02在廣東地區婦女子宮平滑肌瘤患者中高表達,而DRB1*01、*07卻低表達。林泉等［12］研究發現,廣西壯族人群神經纖維瘤病Ⅰ型患者的DRB1*0406、DRB1*1032的頻率顯著高于對照組。我們同時發現,HLA-DRB1*16基因頻率在血管瘤與脈管畸形中表達顯著高于對照組,提示DRB1*16可能為脈管性疾病的易感基因,但是目前查閱到的關于腫瘤及血管畸形與HLA研究的文獻,未發現DRB1*16的異常表達［9-12］。我們的研究還發現,血管瘤組中HLA-DRB1*1401等位基因頻率顯著低于對照組,而脈管畸形組與對照組相比差異無統計學意義,提示HLA-DRB1*1401可能為血管瘤的保護基因。但Zhou等［13］研究發現,江蘇漢族人群DRB1*1401與急性淋巴細胞白血病正相關。

我們的研究結果與國內外關于HLA與其他腫瘤及血管畸形的研究結果并不完全一致,且各個腫瘤與HLA的關系也不一致。造成這些差異可能是由于HLA等位基因頻率在不同民族、不同疾病之間存在差異,這些等位基因只能在某個特定的種族及特定的疾病中才會出現,同時也可能為連鎖不平衡或抗原特異性識別過程中該等位基因介導的改變,這一機制尚待深入研究。由于本研究病例數相對少,仍需今后進一步加大樣本量才能得出更精確的結論。

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Relationship between HLA-DRB1 alleles and vascular anomalies in infants of Han nationality in Guangxi Zhuang Autonomous Region

Wei Nibo*，Chen Shen，Yan Yulin.*Department of Dermatology and Venereology，First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

Yan Yulin，Email:yanyulin0771@163.com

Objective To investigate the relationship between HLA-DRB1 alleles and vascular anomalies in infants of Han nationality in Guangxi Zhuang Autonomous Region.Methods This study included 145 infants with vascular anomalies(99 cases of hemangioma(hemangioma group)and 46 cases of vascular malformation(vascular malformation group))and 105 healthy infants(control group)of Han nationality residing in Guangxi Zhuang Autonomous Region.The genotypes of HLA-DRB1 alleles were determined by using PCR-sequence specific primers(PCR-SSP).Chi-square test was performed to analyze the difference in the frequency of HLA-DRB1 alleles between these groups by using the SPSS 16.0 software.Results There were significant differences in the frequency of HLADRB1*0901，*1401 and*16 alleles among the hemangioma group，vascular malformation group and control group(χ2=13.05，12.79,10.36，respectively，allP＜ 0.01).Paired comparison revealed significant differences in the frequency of HLA-DRB1*0901 allele between the hemangioma group and vascular malformation group(RR=4.84，P＜ 0.01)as well as between the hemangioma group and control group(RR=3.21，P＜ 0.01)，and in the frequency of HLA-DRB1*16 allele between the hemangioma group and control group(RR=2.25，P＜ 0.01)as well as between the vascular malformation group and control group(RR=2.60，P＜ 0.01).The frequency of HLA-DR*1401 allele was significantly lower in the hemangioma group than in the control group(RR=0.30，P＜ 0.01).Conclusions HLA-DRB1*0901 and*16 may be the predisposing genes for hemangioma and vascular anomalies respectively，while HLA-DRB1*1401 appears to be protective against hemangioma，in infants of Han nationality in Guangxi Zhuang Autonomous Region.

Hemangioma；Arteriovenous malformations；HLA antigens；Alleles

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.019

2010年廣西自然科學基金面上項目(2010GXNSFA013169)

530021南寧,廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科(韋妮波、嚴煜林);廣西醫科大學第六附屬醫院口腔科(陳深)

嚴煜林,Email:yanyulin0771@163.com

2013-08-08)

(本文編輯:顏艷)