A375細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路與核因子κB通路的交互作用初探

秦緒艷 臧運書 潘敏 袁夢姝 郁博 吳惠惠

A375細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路與核因子κB通路的交互作用初探

秦緒艷 臧運書 潘敏 袁夢姝 郁博 吳惠惠

目的探討黑素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路與核因子κB(NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交互作用。方法將培養(yǎng)的A375細(xì)胞分為對照組、選擇性ERK信號通路抑制劑U0126(10 μmol/L、5 μmol/L)處理組和選擇性 NF-κB 通路抑制劑 BMS-345541(10 μmol/L、5 μmol/L)處理組,分別提取蛋白質(zhì)和mRNA, 用 Western 印跡、RT-PCR 觀察 U0126抑制 ERK 通路后,NF-κB P65、p-IκBα 蛋白及 NF-κB P65 mRNA的表達(dá),觀察BMS-345541抑制NF-κB通路后ERK1/2、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果應(yīng)用10 μmol/L、5 μmol/L U0126抑制ERK通路后,胞核NF-κB P65蛋白表達(dá)(分別為0.60±0.04、0.56±0.06)均較對照組(1.54±0.15)減少(P＜0.01),其表達(dá)量與藥物濃度無顯著相關(guān)性(P＞0.01);p-IκBα蛋白的表達(dá)(0.90±0.05、0.70±0.02)均較對照組(0.61±0.03)增加(P＜0.01),兩藥物濃度組之間的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);NF-κB P65 mRNA的表達(dá)(0.79±0.05,0.75±0.04)均較對照組(0.86±0.05)減少(P＜0.01)。應(yīng)用10 μmol/L BMS-345541抑制NF-κB通路后,ERK1/2、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表達(dá)(0.73±0.07、0.75± 0.09、1.51± 0.02) 較對照組減少(P＜ 0.01),BMS-345541濃度為 5 μmol/L時,ERK1/2、p-ERK1/2蛋白和ERK1 mRNA的表達(dá)(0.94±0.11、0.99±0.04、1.62±0.03)較對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。結(jié)論NF-κB通路和ERK通路在黑素瘤A375細(xì)胞中存在交互作用。

黑色素瘤;NF-κB;細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)MAP激酶類;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

黑素瘤是一種死亡率高的皮膚腫瘤,對現(xiàn)有的干預(yù)性治療均存在明顯抵抗。有研究證實,核因子κB(NF-κB)在CD437誘導(dǎo)黑素瘤A375細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用［1］,抑制NF-κB通路可增加抗癌藥物的細(xì)胞毒性,從而逆轉(zhuǎn)多元耐藥細(xì)胞的抗藥性［2］。Ras/Raf/MEK/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3］。有研究表明,當(dāng)NF-κB與ERK通路抑制劑分別與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時,可部分增強(qiáng)黑素瘤對藥物的敏感性［4］。可見NF-κB與ERK通路均與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥性有一定關(guān)聯(lián)。本研究對兩者之間的關(guān)系進(jìn)行初探,以期為揭示黑素瘤的分子生物學(xué)基礎(chǔ)提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

一、材料

黑素瘤細(xì)胞A375購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Hyclone公司),胎牛血清、胰蛋白酶(福林生物科技有限公司),選擇性ERK信號通路抑制劑U0126、選擇性NF-κB通路抑制劑BMS-345541(美國Sigma公司),NF-κB P65多克隆抗體(美國 Abcam 公司),p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗體(美國Cell Signaling公司),β肌動蛋白、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);RT-PCR試劑盒(日本 TaKaRa公司);NF-κB P65、ERK1引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:A375用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素)在5%CO2、90%相對濕度、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。分為對照組、U0126(10 μmol/L、5 μmol/L)［5］處理組、BMS-345541(10 μmol/L、5 μmol/L)［6］處理組。對數(shù)生長期細(xì)胞生長至約70%時,換無血清培養(yǎng)液同步化處理,經(jīng)12～14 h按照上述分組加入藥物作用24 h,對照組加入與藥物等體積的培養(yǎng)液。

2.Western 印 跡 檢 測 NF-κB P65、p-IκBα、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達(dá):提取經(jīng)上述處理的各組細(xì)胞總蛋白、核蛋白,制膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜, 一抗 NF-κB P65(1∶400)、p-IκBα(1∶500)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)和 β 肌動蛋白(1∶1 000)孵育4℃過夜,用吐溫20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3次,每次10 min,然后分別加二抗抗兔IgG(1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1 h,用PBST洗3次,每次5 min,PBS洗3次,每次5 min。用化學(xué)發(fā)光法顯色,X線片曝光,顯影。

3.RT-PCR檢測細(xì)胞中NF-κB P65 mRNA及ERK1 mRNA的表達(dá):取各組經(jīng)不同處理的細(xì)胞,Trizol法提取總RNA后參照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,然后進(jìn)行 PCR反應(yīng)。NF-κB P65上游引物:5'-TCAATGGCTACACAGGACCA-3',下游引物5'-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3',目的片段長度為308 bp,退火溫度56℃。ERK1上游引物:5'-ACCCACACAAGAGGATTGAAGT-3',下游引物:5'-GAAAGCATAAAAGCCACAACTACC-3',目的片段長度為361 bp,退火溫度58℃。GAPDH上游引物:5'-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3',下游引物:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3',目的片段長度為146 bp,退火溫度同目的引物。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,98℃變性10 s、退火30 s、72℃延伸30 s,循環(huán)35次后,72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后凝膠成像。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

每個檢測重復(fù)至少3次。用Quantity One軟件分析,數(shù)值以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示(p-ERK1/2蛋白條帶灰度值與ERK1/2蛋白條帶灰度值相比較),形式為±s。用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、U0126 抑制 ERK 通路對NF-κB P65、p-IκBα蛋白表達(dá)的影響

分別用 10 μmol/L 、5 μmol/L U0126 抑制 ERK通路24 h后,胞核NF-κB P65蛋白的表達(dá)較對照組明顯減少(P＜ 0.01),10 μmol/L組和 5 μmol/L組的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01);p-IκBα蛋白的表達(dá)均較對照組升高(P＜0.01),且兩藥物濃度之間的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),見表1、圖1。兩組ERK1/2蛋白的表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01),p-ERK1/2蛋白的表達(dá)較對照組減少(P＜ 0.01),見表 1、圖 2。

二、BMS-345541抑制NF-κB通路對 ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

用 10 μmol/L BMS-345541 抑制 NF-κB 通路24 h后,可見ERK通路中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)均較對照組減少(P＜0.01),5 μmol/L BMS-345541作用24 h后ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)較對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01),見表1、圖 2。 分別用 10 μmol/L、5 μmol/L BMS-345541 抑制NF-κB通路后,胞核NF-κB P65蛋白表達(dá)均較對照組減少(P＜0.01),而兩濃度間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01),見表1、圖1。

表1 分別阻斷A375細(xì)胞兩通路后Western印跡檢測P65(胞核)、p-IκBα、ERK、p-ERK 的表達(dá)(±s,n≥3)

表1 分別阻斷A375細(xì)胞兩通路后Western印跡檢測P65(胞核)、p-IκBα、ERK、p-ERK 的表達(dá)(±s,n≥3)

注:a:與對照組相比P＜0.01,b:與10 μmol/L U0126組相比P＜0.01,c:與10 μmol/L BMS-345541組相比P＜0.01

組別 P65 p-IκBα ERK p-ERK對照組 1.54±0.15 0.61±0.03 0.99±0.03 0.92±0.08 U0126 10 μmol/L組 0.60±0.04a 0.90±0.05a 1.18±0.11 0.46±0.03a 5 μmol/L組 0.56±0.06a 0.70±0.02ab 0.95±0.08b 0.72±0.03ab BMS-345541 10 μmol/L組 0.65±0.07a 0.56±0.03a 0.73±0.07a 0.75±0.09a 5 μmol/L組 1.27±0.03ac 0.58±0.01a 0.94±0.11 0.99±0.04c F值 177.37 111.61 17.13 61.37 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

三、U0126抑制ERK通路對NF-κB P65 mRNA表達(dá)的影響

分別用 10 μmol/L、5 μmol/L U0126 抑制 ERK通路24 h后,NF-κB P65 mRNA的表達(dá)均較對照組減少(P＜0.01),兩藥物濃度間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);ERK1 mRNA的表達(dá)均較對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01),見表2。

四、BMS-345541抑制 NF-κB通路對 ERK1 mRNA表達(dá)的影響

用 10 μmol/L BMS-345541 抑制 NF-κB 通路24 h后,ERK1 mRNA的表達(dá)較對照組減少(P＜0.01),而藥物濃度為5 μmol/L時較對照組的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01);NF-κB P65 mRNA的表達(dá)均較對照組減少(P＜0.01),見表2。

圖1 阻斷ERK通路后Western印跡檢測A375細(xì)胞NF-κB P65(胞核)及p-IκBα 的表達(dá) 1:對照組;2:10 μmol/L U0126組;3:5 μmol/L U0126 組;4:10 μmol/L BMS-345541 組;5:5 μmol/L BMS-345541組

圖2 阻斷NF-κB通路后Western印跡檢測A375細(xì)胞ERK及p-ERK的表達(dá) 1:對照組;2:10 μmol/L U0126組;3:5 μmol/L U0126組;4:10 μmol/L BMS-345541 組;5:5 μmol/L BMS-345541 組

討 論

U0126是一種有較高選擇性的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制劑,可直接穿過胞膜進(jìn)入胞質(zhì),選擇性抑制MEK1/2的激活,從而抑制下游ERK1/2的磷酸化［7］。本研究也證實這一點,U0126組中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)較對照組減少,而ERK1/2蛋白的表達(dá)較對照組不變,證實U0126阻斷ERK活化從而抑制ERK通路,與本課題組前期研究結(jié)果一致［5］。 郭慧等［8］在表達(dá)丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3(HCV NS3)肝細(xì)胞中阻斷ERK信號通路,NF-κB的DNA結(jié)合活性明顯降低,且呈劑量依賴關(guān)系。而Lu等［9］發(fā)現(xiàn)在脊髓的缺血再灌注損傷中,阻斷MEK/ERK通路導(dǎo)致NF-κB的DNA結(jié)合活性增加。在本研究中,當(dāng)用U0126抑制ERK通路后,NF-κB通路中胞核NF-κB P65蛋白和NF-κB P65 mRNA的表達(dá)明顯減少,說明在黑素瘤細(xì)胞A375中抑制ERK通路后可導(dǎo)致NF-κB通路的激活減少。由此我們推測在不同的細(xì)胞中抑制ERK通路對NF-κB通路的影響并不是固定的,可能在同一細(xì)胞不同狀態(tài)時亦不一致,可見信號傳導(dǎo)通路之間調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。

表2 分別阻斷A375細(xì)胞兩通路后RT-PCR檢測NF-κB P65 mRNA及ERK1 mRNA的表達(dá)(±s,n≥3)

表2 分別阻斷A375細(xì)胞兩通路后RT-PCR檢測NF-κB P65 mRNA及ERK1 mRNA的表達(dá)(±s,n≥3)

注:a:與對照組相比P＜0.01,b:與10 μmol/L U0126組相比P＜0.01,c:與10 μmol/L BMS-345541組相比P＜0.01

組別 P65 mRNA ERK1 mRNA對照組 0.86±0.05 1.63±0.03 U0126 10 μmol/L組 0.79± 0.05a 1.62± 0.03 5 μmol/L組 0.75± 0.04ab 1.62± 0.02 BMS-345541 10 μmol/L組 0.71±0.03a 1.51±0.02a 5 μmol/L組 0.78± 0.03ac 1.62± 0.03c F值 15.18 19.58 P值 ＜0.01 ＜0.01

BMS-345541是IKK水解亞單位的高度選擇性抑制劑。在本研究中,證實BMS-345541使活化的NF-κB P65蛋白和p-IκBα蛋白減少。同時在本研究中發(fā)現(xiàn),用BMS-345541抑制NF-κB通路后,高濃度組ERK1/2、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表達(dá)減少,而低濃度組ERK1/2、p-ERK1/2蛋白、ERK1 mRNA表達(dá)無明顯改變。我們推測BMS-345541可能對ERK1/2的表達(dá)亦有直接抑制作用,有效濃度與抑制NF-κB通路時不同,但尚需進(jìn)一步試驗證實。Qing等［10］在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中用NF-κB通路抑制劑BAY11-7082抑制NF-κB通路時可顯著阻斷ERK和p38的磷酸化,與我們的試驗結(jié)果一致。但我們的試驗結(jié)果顯示,BMS-345541對ERK1/2磷酸化起抑制作用時的藥物濃度較抑制NF-κB通路時的有效濃度高,但該結(jié)論及具體有效濃度尚需進(jìn)一步研究證實。

ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程從胞質(zhì)到胞核,涉及多條通路和多個激酶的活化,并且各級激酶之間存在交匯作用,NF-κB通路作用也相當(dāng)廣泛,多種刺激和激酶均可通過蛋白酶體途徑使IκB降解從而活化NF-κB,NF-κB活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)對基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行廣泛調(diào)控［11］。在黑素瘤細(xì)胞A375中兩通路之間的作用有無關(guān)聯(lián)尚無報道。Dhawan等［12］認(rèn)為在人黑素瘤細(xì)胞Hs294T中ERK通路是NF-κB通路的上游并且控制 NF-κB 的 DNA 結(jié)合活性。 Zhang等［13］發(fā)現(xiàn),在鼠平滑肌細(xì)胞中活性氧產(chǎn)物激活ERK1/2,進(jìn)而激活NF-κB引起金屬蛋白酶9基因轉(zhuǎn)錄,參與主動脈瘤、主動脈夾層的發(fā)生。Qing等［10］試驗結(jié)果表明,NF-κB與MAPK通路之間存在交互作用,本研究通過用抑制劑抑制其中一個通路時,另一通路的蛋白質(zhì)表達(dá)有改變,對基因表達(dá)水平亦有一定影響,推測在黑素瘤中NF-κB與ERK信號通路間存在潛在的交互作用,且兩信號通路之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系,呈現(xiàn)抑制抑或激活作用可能依賴細(xì)胞種類及細(xì)胞狀態(tài),其中涉及的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Cross-talk between nuclear factor-κB and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways in A375 human melanoma cells

Qin Xuyan，Zang Yunshu，Pan Min，Yuan Mengshu，Yu Bo，Wu Huihui.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China

Pan Min，Email:pan730412@126.com

Objective To investigate the cross-talk between extracellular signal-regulated kinase(ERK)and nuclear factor κB(NF-κB)signal transduction pathways in A375 human melanoma cells.Methods Cultured A375 cells were randomly divided into 5 groups:control group receiving no treatment，two U0126(a selective inhibitor of the ERK signaling pathway)groups treated with U0126 of 10 and 5 μmol/L，and two BMS-345541 groups treated with BMS-345541 of 10 and 5 μmol/L.After 24-hour treatment，Western blot and reverse transcription PCR were performed to measure the protein expressions of NF-κB P65，phosphorylated IκBα(p-IκBα)，ERK1/2，as well as p-ERK1/2，and the mRNA expressions of NF-κB P65 and ERK1，respectively.One-way analysis of variance and least significant difference(LSD)-ttest were carried out for statistical analysis.Results After 24 hours of treatment with U0126 of 10 and 5 μmol/L，a significant decrease was noted in the relative expression level of NF-κB p65 protein(0.60±0.04 and 0.56±0.06 vs.1.54±0.15，bothP＜0.01)and mRNA(0.79±0.05 and 0.75 ± 0.04 vs.0.86 ± 0.05，bothP＜ 0.01)，but a statistical increase in that of p-IκBα protein(0.90 ± 0.05 and 0.70±0.02 vs.0.61±0.03，bothP＜0.01)in the two U0126 groups compared with the control group；significant differences were observed in the expression level of p-IκBα protein(P＜ 0.01)but not in that of NF-κB p65 protein(P＞0.01)between the two U0126 groups.The relative expression levels of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins as well as ERK1 mRNA were significantly higher in the control A375 cells than those in the cells treated with BMS-345541 of 10 μmol/L(0.73 ± 0.07,0.75 ± 0.09,1.51 ± 0.02，allP＜ 0.01)，but similar to those treated with BMS-345541 of 5 μmol/L(0.94 ± 0.11，0.99 ± 0.04,1.62 ± 0.03，allP＞ 0.05).Conclusion There is a cross-talk between ERK and NF-κB signal transduction pathways in A375 melanoma cells.

Melanoma;NF-kappa B;Extracellular signal-regulated MAP kinase;Signal transducting

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.011

山東省自然科學(xué)基金(ZR2010HM022);山東省科技發(fā)展計劃(2011YD18012)

266003青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

潘敏,Email:pan730412@126.com

2013-11-18)

(本文編輯:吳曉初)