HS-SPME同時萃取衍生化定量白酒中反-2-烯醛和二烯醛類化合物

曹長江，范文來，聶 堯，徐 巖

(教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學生物工程學院釀酒微生物與應用酶學研究室，江蘇無錫214122)

醛類是飲料酒香氣重要成分，由微生物發酵及脂肪［1］和醇類［2］氧化產生。反-2-烯醛和二烯醛類屬于不飽和醛類，在飲料酒中的含量低［3-6］，但由于其較低的閾值［7］，對飲料酒的香氣有很大貢獻［4］。

碘量法和比色法是醛類檢測的常規方法［2］，主要檢測白酒中醛類總量。利用頂空固相微萃取(HS-SPME)檢測白酒中醛類，受到醛類極性、沸點、萃取頭類型，以及飲料酒基質干擾的影響，導致檢測靈敏度不高，只能定量白酒中部分飽和醛［8-9］。采用衍生化方法，能提高檢測靈敏度，去除基質干擾。常見衍生化試劑有 2，4-二硝基苯肼［10］、五氟苯肼［11］以及鄰五氟苯甲基羥胺(PFBHA)［3，12-13］等，其中 PFBHA具有衍生效率高，衍生劑用量小等特點［12］，如López-Vázquez［3］等用 PFBHA 衍生化 SPME 法在葡萄皮渣蒸餾酒中定量檢測5種反-2-烯醛和4種二烯醛類化合物;Saison［4］等利用 PFBHA衍生化 SPME法檢測啤酒中6種反-2-烯醛和1種二烯醛類化合物;Sowiński［6］等利用 PFBHA 衍生化檢測伏特加酒中 2種反-2-烯醛和 8種飽和醛。Ferreira［13］等利用PFBHA衍生結合固相萃取(SPE)應用GC-MS定量檢測葡萄酒中反-2-壬烯醛和反，順-2，6-二烯醛。

中國白酒中醛類檢測主要集中在總醛和飽和醛類上。李俠［14］利用光度法測定白酒中醛類總量，王曉欣［8］利用HS-SPME結合GC-MS檢測濃香型習酒香氣物質時，檢測到乙醛、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、己醛、壬醛、癸醛等6種飽和醛類，張燦［15］利用浸入固相微萃取檢測白酒中異嗅化合物時，檢測到反-2-壬烯醛(檢測限為1．55μg/L)。范文來［16］等利用液液萃取結合正相色譜，采用GC-MS的檢測方法，在我國清香型和醬香型白酒中共定性出6種反-2-烯醛和6種二烯醛類化合物，沒有對其進行準確定量。

本實驗運用PFBHA作衍生化試劑，HS-SPME同時萃取衍生和GC-MS聯用的方法共定量我國白酒中14種反-2-烯醛和二烯醛類化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

反-2-戊烯醛(純度 95%)、反-2-己烯醛(95%)、反-2-庚烯醛(95%)、反-2-辛烯醛(94%)、反-2-壬烯醛(97%)、反，反-2，4-己二烯醛(95%)、反，反-2，4-庚二烯醛(88%)、反，反-2，4-辛二烯醛(95%)、反，反-2，4-壬二烯醛(85%)、反，反-2，4-癸二烯醛(85%)、反，順-2，6-壬二烯醛(95%)、對氟苯甲醛(內標，98%)、鄰五氟苯甲基羥胺(PFBHA，98%)Sigma-Aldrich公司;乙醇 色譜純，上海安譜科學儀器公司;氯化鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;水 超純水，Milli-Q系統純化。

氣相色譜質譜聯用儀，Agilent GC 6890-MSD 5975 美國Agilent公司;自動進樣裝置(MPS2) 德國Gestel公司;Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司;DVB/CAR/PDMS三相萃取頭 加拿大Supelco公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 內標、反-2-烯醛和二烯醛類標準液及衍生劑溶液的配制 參照文獻［4］，準確稱量14．30mg的對氟苯甲醛(內標)，用色譜純乙醇定容至100mL，再用色譜純乙醇稀釋500倍(濃度為1．0724mg/L)，-20℃儲存，作為內標溶液以備使用。分別準確稱取1．86～5．77mg的14種反-2-烯醛和二烯醛類標準品，溶解于100mL色譜純乙醇，-20℃儲存，作為單標溶液以備使用。

1．2．2 樣品預處理 用煮沸后冷卻至室溫的超純水將酒樣稀釋至酒精度10%vol，準確吸取8mL置于20mL頂空瓶中，加入8μL內標對氟苯甲醛溶液(最終濃度為 1．0724μg/L)和 300μL 的衍生化試劑PFBHA溶液，旋緊瓶蓋，待分析。

1．2．3 HS-SPME同時萃取衍生化條件優化 參考López-Vázquez［3］的方法，同時萃取衍生化。用自動進樣裝置(MPS2)進行樣品HS-SPME同時萃取衍生化，衍生反應時間為10min，酒樣稀釋至10%vol，同時萃取衍生化溫度為65℃，萃取衍生化時間為45min，加 3g NaCl。

對主要參數進行優化。考察酒精度(10%vol、20%vol和30%vol)、同時萃取衍生化溫度(45、50、55、60、65、70 和 80℃)、同時萃取衍生化時間(15、30、45和60min)和離子強度對反-2-烯醛和二烯醛類檢測的影響。

1．2．4 GC-MS 條件 GC 條件:載氣 He(純度99．9995%)，流速 2mL/min，不分流進樣;色譜柱:DB-Wax(60m × 0．25mm × 0．25μm)。進樣口溫度250℃，解吸附300s。升溫程序為:50℃保持2min，以6℃ /min升至 100℃，保持 0．1min，以 2℃ /min 升至160℃，保 持 0．1min，以 5℃/min 升 至 230℃，保持15min。

MS條件:電子電離(EI)，電子能量70eV，離子源溫度 230℃，SCAN 模式掃描范圍為 35．00～380．00amu。質譜分析使用NIST05a．L數據庫。

1．2．5 定性和定量 通過對比衍生化后酒樣和反-2-烯醛和二烯醛類標準品衍生后的保留時間以及NIST05a．L數據庫提供的質譜圖對照，利用匹配度、特征離子以及保留時間進行定性分析。

用選擇特征定量離子(SIM)的方法對反-2-烯醛和二烯醛類衍生物進行積分，衍生產物有順，反異構體的，以兩個離子峰面積之和計算(見圖1)。以14種反-2-烯醛和二烯醛類衍生物特征離子峰與內標的特征離子峰(m/z 319)的峰面積之比為橫坐標(x)，反-2-烯醛和二烯醛類與內標濃度之比為縱坐標(y)繪制標準曲線。

向白酒樣品中添加與酒中濃度相近的、相應的反-2-烯醛和二烯醛類標準溶液，進行回收率和精密度測定。

2 結果與討論

醛類化合物與PFBHA反應得到的衍生產物，除個別形成單峰，一般是兩個色譜峰(即順，反異構體)［17-18］。本實驗研究的醛類除反-2-壬烯醛和反，順-2，6-壬二烯醛的衍生產物為單峰，其他均為兩個峰，如圖1所示。計算峰面積時，除反-2-壬烯醛和反，順-2，6-壬二烯醛為一個離子峰外，其他物質均以兩個離子峰面積總和來計算。

2.1 同時萃取衍生條件優化

本研究共涉及14種反-2-烯醛和二烯醛，包括8種反-2-烯醛類和6種二烯醛類。根據化合物結構相似，性質相似的原理，選取反-2-壬烯醛和反，反-2，4-壬二烯醛分別代表反-2-烯醛類和二烯醛類化合物，進行萃取條件優化。考察了影響不飽和醛類同時萃取衍生效率的因素主要包括酒精度、萃取溫度、萃取時間、離子濃度等。

2．1．1 酒精度的優化 酒精度優化時分別選取10%vol，20%vol和30%vol三個酒精度，結果以相對峰面積比值表示(相對峰面積比值:同一物質在不同酒精度下的峰面積中，選取最大峰面積并設定為100，其他酒精度條件的峰面積除以最大值的實際值，得到的比值)。由圖2可以看出:20%vol和30%vol的酒精度下，兩個化合物的萃取效果都顯著降低。10%vol的酒精度的萃取效果最好。這一結果與早期研究白酒微量成分檢測與香氣［19］時采用的酒精度一致，所以選取10%vol的酒精度為樣品測定酒精度。

圖1 豉香型白酒樣品與PFBHA反應的反-2-烯醛和二烯醛類衍生物離子圖譜Fig．1 Extracted ions chromatograms of trans-2-alkenals and alkadienals oxime derivatives of soybean aroma type liquor

2．1．2 萃取溫度的選擇 由圖3可以看出，萃取效率隨萃取溫度升高先上升后下降，這一趨勢與文獻報道一致［4］。當萃取溫度升到65℃時，反-2-壬烯醛和反，反-2，4-壬二烯醛的萃取效果最好，溫度繼續升高，萃取效率降低。溫度從40℃升高到65℃過程中，不飽和醛反-2-烯醛和二烯醛類化合物隨著溫度的升高從酒樣中揮發到空氣中，從而增加萃取頭的吸附效率;但當溫度繼續升高時，加速了萃取頭上不飽和醛類的解吸附，降低了萃取效率。Sowiński［6］驗證了在30、50和70℃條件下，PFBHA衍生產物的萃取效率，結果為70℃的萃取效率最高，與本研究結果接近。故選擇65℃作為實驗萃取溫度。

圖2 不同酒精度下的萃取效果Fig．2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

圖3 不同萃取溫度下的萃取效果Fig．3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2．1．3 萃取時間的選擇 López-Vázquez［3］等人選取2、5、10min和15min考察了衍生反應時間，結果顯示衍生反應時間對萃取結果沒有影響，這可能是醛類和PFBHA反應迅速，所需時間小于2min。本實驗選擇預熱5min作為反應時間進行萃取時間優化。

由圖4可見，當萃取時間從15min增加到45min時，不飽和醛類的萃取效率顯著增加，萃取時間超過45min后，不飽和醛類的萃取效率增加幅度不大，趨于平衡，此時達到吸附和解吸附平衡。Saison［4］報道萃取時間40min，二者結果相似。故選取45min為樣品萃取時間。

2．1．4 離子強度 由圖5可見，樣品中離子強度較大時(即加入3g NaCl飽和，使樣品溶液飽和)，萃取效率高于離子強度較低時(即不添加NaCl)。為了得到最佳萃取效果，選擇樣品中加入3g NaCl，再進行萃取。

文獻中報道溶液離子強度對萃取效率的影響并不一致。這一結果與 Saison［5］和 Sowiński［6］的結論一致，Saison認為液相中離子強度增加，提高了液相中化合物擴散到氣相的比例，從而提高頂空萃取效率［5］，NaCl的添加有助于提高萃取效率。而 López-Vázquez［3］實驗結果與此相反，即 NaCl的添加降低萃取效率，認為高的離子濃度影響醛類衍生物的形成，從而影響醛類衍生物萃取效率。

表1 反-2-烯醛和二烯醛類的定量相關參數Table 1 Quantification parameters of trans-2-alkenals and alkadienals

圖4 不同萃取時間的萃取效果Fig．4 Effect of extraction time on extraction efficiency

圖5 不同離子濃度下的萃取效果Fig．5 Effect of ionic concentration on extraction efficiency

因此，HS-SPME同時萃取衍生化的條件是酒樣稀釋到酒精度10%vol，樣品中加入3g NaCl，同時萃取衍生化溫度65℃，萃取衍生化時間45min。

2.2 線性范圍與檢測限

由表1可知，該方法對于14種反-2-烯醛和二烯醛類有很寬的線性范圍，線性關系很好，相關系數(R2)均在0．9924(反-2-辛烯醛)以上。選取信噪比為3時的質量濃度作為檢測限(limit of detection，LOD)，檢測限從 0．014μg/L(反 -2- 庚烯醛)到0．186μg/L(反-2-十一烯醛)，較 HS-SPME 非衍生化檢測方法(反-2-壬烯醛，檢測限 1．55μg/L)［15］更低，能滿足白酒中低濃度不飽和醛類的檢測要求。

2.3 精密度和回收率實驗

由表2可知，14種反-2-烯醛和二烯醛類化合物的回收率在84．47%～116%之間，RSD值均小于10．99%。說明該方法有良好的準確度和精密度，能夠滿足分析要求。

2.4 白酒中反-2-烯醛類和二烯醛類化合物的檢測結果

選取了濃香型、清香型、醬香型等8種香型白酒的原酒定量檢測，檢測結果見表3。

在檢測的8種香型的白酒中，豉香型白酒不飽和醛類總量最高，達1077．36μg/L(表3)，醬香型和兼香型白酒的不飽和醛類總量最低，小于32．95μg/L，其他各香型白酒中不飽和醛類總量在107．30～141．50μg/L范圍。其中含量最高的是豉香型白酒中反-2-辛烯醛，達301．86μg/L。一般情況下，白酒中的反-2-烯醛類總量高于二烯醛類化合物，不同香型白酒中反-2-烯醛類和二烯醛類含量各不相同，這一現象可能與白酒釀造的原料和工藝有關，需要進一步的研究。

3 結論

應用鄰五氟苯甲基羥胺(PFBHA)作衍生化試劑，采用HS-SPME同時萃取衍生化結合GC-MS技術，建立了白酒中反-2-烯醛和二烯醛類的定性、定量方法。該方法準確度、精密度高，檢測限低，并且定量檢測反-2-烯醛和二烯醛類的種類達到14種，能滿足白酒中反-2-烯醛類和二烯醛類化合物的檢測要求，有助于分析比較不同白酒產品之間的重要風味物質差別，為白酒品質的改進提供必要的手段和相關理論依據。

表2 白酒中反-2-烯醛和二烯醛類化合物的加標回收率和精密度(n=3)Table 2 Accuracy and standard recovery tests of trans-2-alkenals and alkadienals in Chinese liquor(n=3)

［1］范文來，徐巖．酒類風味化學［M］．北京:中國輕工業出版社，2014:103-104．

［2］沈怡方．白酒生產技術全書［M］．北京:中國輕工業出版社，1998:660-661．

［3］López-Vázquez C，Orriols I，Perelló M-C，et al．Determination of aldehydes as pentafluorobenzyl derivatives in grape pomace distillates by HS-SPME-GC/MS［J］．Food Chemistry，2012，130(4):1127-1133．

［4］Saison D，De Schutter D P，Delvaux F，et al．Determination of carbonyl compounds in beer by derivatisation and headspace solid-phase microextraction in combination with gas chromatography and mass spectrometry［J］．Journal of chromatography A，2009，1216(26):5061-5068．

［5］Saison D，De Schutter D P，Delvaux F，et al．Optimization of a complete method for the analysis of volatiles involved in the flavour stability of beer by solid-phase microextraction in combination with gas chromatography and mass spectrometry［J］．Journal of chromatography A，2008，1190(1):342-349．

［6］Sowiński P，Wardencki W，Partyka M．Development and evaluation of headspace gas chromatography method for the analysis of carbonyl compounds in spirits and vodkas［J］．Analytica chimica acta，2005，539(1):17-22．

［7］Saison D，De Schutter D P，Uyttenhove B，et al．Contribution of staling compounds to the aged flavour of lager beer by studying their flavour thresholds［J］．Food Chemistry，2009，114(4):1206-1215．

［8］王曉欣，徐巖，范文來，等．濃香型習酒揮發性香氣成分研究［J］．釀酒科技，2013(1):31-38．

［9］高文俊，范文來，徐巖．西北高原青稞酒重要揮發性香氣成分［J］．食品工業科技，2013，22:49-53，57．

［10］Zwiener C，Glauner T，Frimmel F．Method optimization for the determination of carbonyl compounds in disinfected water by DNPH derivatization and LC-ESI-MS-MS［J］．Analytical and Bioanalytical Chemistry，2002，372(5-6):615-621．

［11］Kobayashi K，Tanaka M，Kawai S，et al．Gas chromatographic determination of low-molecular-weight carbonyl compounds in aqueous solutions as their pentafluorophenylhydrazones［J］．Journal of chromatography A，1979，176(1):118-122．

［12］Ojala M，Kotiaho T，Siiril? J，et al．Analysis of aldehydes and ketones from beer as O-(2，3，4，5，6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine derivatives［J］．Talanta，1994，41(8):1297-1309．

［13］Ferreira V，Culleré L，López R，et al．Determination of importantodor- active aldehydes of wine through gas chromatography-mass spectrometry of their O-(2，3，4，5，6-pentafluorobenzyl)oximes formed directly in the solid phase extraction cartridge used for selective isolation［J］．Journal of chromatography A，2004，1028(2):339-345．

［14］李俠，柳玉英．白酒中醛類物質的光度法測定［J］．山東理工大學學報:自然科學版，2006，4:19．

［15］張燦，徐巖，范文來．不同吸附劑對白酒異嗅物質去除的研究［J］．食品工業科技，2012，33(23):60-65．

［16］范文來，徐巖．應用液液萃取結合正相色譜技術鑒定汾酒與郎酒揮發性成分(上)［J］．釀酒科技，2013(2):17-26．

［17］Sugaya N，Nakagawa T，Sakurai K，et al．Analysis of aldehydes in water by head space-GC/MS［J］．Journal of Health Science，2001，47(1):21-27．

［18］Culleré L，Cacho J，Ferreira V．Analysis for wine C5-C8 aldehydes through the determination of their O-(2，3，4，5，6-pentafluorobenzyl)oximes formed directly in the solid phase extraction cartridge［J］．Analytica chimica acta，2004，524(1):201-206．

［19］Fan W，Shen H，Xu Y．Quantification of volatile compounds in Chinese soy sauce aroma type liquor by stir bar sorptive extraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91(7):1187-1198．