超聲輔助提取黑豆蛋白及其功能性質的研究

王 晶，馬文君，陳 勇，王中江，王 瑞，李 楊，柏 晶，江連洲，2，*

(1.東北農業大學食品學院，哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心哈爾濱150030)

黑豆又名櫓豆、料豆、零烏豆，它呈卵圓形或球形，表皮黑色或深綠色，全國各地均有生產，以東北產量最多［1］。黑豆含有豐富的蛋白質，含粗蛋白質34%，每100g黑豆含蛋白質最高可達49.8%，比黃豆高 24.5%［2］，甚至高于肉類、雞蛋和牛奶，素有“植物蛋白之王”的美譽［3］。

傳統的蛋白的提取工藝是堿提酸沉法，但該法存在提取率較低，提取時間較長，溶劑消耗量大等缺點［4］。超聲輔助提取技術可以促進固體物料中有效成分的溶出，能有效地提高提取效率［5］，降低成本［6］。但同時會對蛋白分子結構和功能特性產生影響［7-10］。

本文堿溶酸沉法的基礎上采用超聲波輔助提取黑豆蛋白，以蛋白提取率為指標，利用單因素實驗和響應曲面設計法分析不同因素對總蛋白提取效果的影響，并對提取工藝進行了條件優化。并探究超聲波輔助提取對黑豆蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩定性、起泡性及泡沫穩定性等功能性質的影響，為高效提取黑豆蛋白及其開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆 由北大荒綠野食品有限公司提供，脫皮粉碎后過60目篩，正己烷萃取以制備脫脂黑豆粉，晾干備用;Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司;氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷、鹽酸等試劑 國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司;錘片式粉碎機 中國天津泰斯特儀器有限公司TU-1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司;電子分析天平(0.0001g)北京賽多利斯儀器系統有限公司;高速離心機 德國Eppendorf公司;FJ300-S數顯高速分散均質機 上海越磁電子科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑豆原料成分的測定 水分的測定:GB304-87進行測定;粗脂肪的測定:GB5512-85中索氏抽提法進行測定;粗蛋白的測定:GB6432-94標準方法進行;灰分測定:GB5009.4-85。

1.3.2 超聲輔助提取黑豆蛋白工藝流程與方法

1.3.2.1 超聲輔助提取黑豆蛋白工藝流程 黑豆→清理→粉碎→過篩→脫脂→加堿液調pH至8→超聲處理→離心分離→取上清液→加酸液調pH至4.5→離心分離→取沉淀→反復水洗和離心→黑豆蛋白

1.3.2.2 傳統提取黑豆蛋白工藝流程 黑豆→清理→粉碎→過篩→脫脂→加堿液調pH至8→離心分離→取上清液→加酸液調pH至4.5→離心分離→取沉淀→反復水洗和離心→黑豆蛋白

1.3.2.3 蛋白提取率計算公式

蛋白提取率(%)=提取黑豆蛋白的質量/(脫脂黑豆粉質量×45.1%)×100

注:45.1%為原料黑豆測得的蛋白含量。

1.3.2.4 超聲輔助提取黑豆蛋白單因素實驗 以黑豆蛋白提取率為評價指標，研究不同液固比、pH、超聲功率及超聲時間對提取黑豆蛋白的主要影響。

1.3.2.5 超聲輔助提取黑豆蛋白響應面實驗 在單因素研究的基礎上，確定各因素的水平值范圍，采用響應面中心組合實驗設計，選取液固比，混合液pH，超聲強度，超聲時間4個因素為自變量，以黑豆蛋白提取率為響應值，優化超聲輔助提取黑豆蛋白工藝的最佳參數。其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.3.3 超聲輔助提取黑豆蛋白功能性測定

1.3.3.1 溶解性測定 稱取100mg黑豆蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌30min，20℃、12000×g離心20min。上清液經適度稀釋，采用Lowry法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白質量濃度占總蛋白質量濃度的百分比［11］。

1.3.3.2 乳化性及乳化穩定性測定 將24mL蛋白濃度為0.2%(w/v)的蛋白溶液與8mL大豆油混合，在13500r/min高速均質機下乳化2min，，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，立即開始取樣，用微量注射器迅速從底部吸取乳化液50μL與5mL，0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液均勻混合，在500nm處測定其吸光值，記為 A0，用0.1%的 SDS做空白對照［12］。按下式計算乳化性(emulsifying capacity，EC):

其中T=2.303，N:稀釋倍數250，C:乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度(g/mL)，U:乳化液中油的體積分數(0.25)。

將乳狀液靜置30min后采用用相同的方法測定乳狀液吸光值，記為A30，用0.1%的SDS做空白對照。按下式計算乳化穩定性(emulsifying stability，ES):

1.3.3.3 起泡性及起泡穩定性測定 將一定濃度的SPI溶液100mL置于500mL量筒中，使用高速乳化均質機以17500r/min的速度均質40s，連續3次共計2min，記錄均質后的液面高度，記為V0，靜置30min后再次記錄液面高度，記為 V30［13］。起泡能力(Foaming Capacity)和泡沫穩定性(Foaming Stability)公式如下:

1.3.4 數據處理 采用SAS9.2統計分析軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 黑豆的主要成分

黑豆的主要成分如表2所示。

表2 黑豆的主要成分(%)Table 2 The main components of soybean(%)

2.2 超聲輔助提取單因素條件對黑豆蛋白提取率的影響

2.2.1 液固比對黑豆蛋白提取率的影響 液固比對提取率的影響如圖1。由圖1可知，隨著液固比的升高，蛋白質提取率先升高而后緩慢下降。在低液固比的條件下，體系分散不均，蛋白質無法充分溶解［14］，但當液固比大于9∶1蛋白質提取率明顯增加，這時稀釋作用大于蛋白質的溶出。但當液固比大于13∶1，蛋白質提取率呈下降趨勢，所以在下面的響應面實驗設計中液固比選擇 9∶1～13∶1。

2.2.2 pH對黑豆蛋白提取率的影響 pH對提油率的影響見圖2。如圖2可知，在液固比0.09，超聲時間20min，超聲功率300W條件下，隨著pH的增加，蛋白提取率逐漸增加，當pH在9～11附近有較大值出現，提取率最高，這可能是因為堿性條件下，蛋白分子結構疏松，堿液對蛋白有增容效果，而后隨著pH的增加，堿性的增強，蛋白質易發生變性，營養價值降低，提取率下降［5］。所以在下面的響應面實驗設計中pH選擇9～11。

圖1 液固比對黑豆蛋白提取率的影響Fig.1 Liquid-material ratio on the effect of protein extraction

圖2 pH對黑豆蛋白提取率的影響Fig.2 pH on the effect of protein extraction

2.2.3 超聲功率對黑豆蛋白提取率的影響 超聲功率對蛋白提取率的影響見圖3。如圖3所示，當功率大于200W時，提取率上升，變化程度較明顯，超聲有助于蛋白分子的展開，增加了與水分子的接觸面積，促進了蛋白的溶解。當功率大于300W時，提取率下降，這可能是因為超聲功率增加伴隨熱效應，使蛋白發生變性，影響溶出效果，導致提取率下降［15］。所以在下面的響應面實驗設計中超聲功率選擇200～400W。

圖3 超聲功率對黑豆蛋白提取率的影響Fig.3 Ultrasonic power on the effect of protein extraction

2.2.4 超聲時間對黑豆蛋白提取率的影響 超聲時間對蛋白提取率的影響見圖4。如圖4所示，當時間大于15min時，提取率大幅上升，變化程度較明顯，當時間大于20min時，提取率開始下降，原因是20min時水溶性蛋白已被浸提出來，浸提液濃度達到平衡，延長超聲時間，超聲產生的空穴效應和熱效應會使蛋白部分發生變性，造成提取率的下降［16］。所以在下面的響應面實驗設計中超聲時間選擇15～25min。

圖4 超聲時間對黑豆蛋白提取率的影響的影響Fig.4 Ultrasonic time on the effect of protein extraction

2.3 超聲輔助提取工藝的響應面優化實驗

2.3.1 響應面實驗安排及實驗結果 本實驗應用響應面優化法進行過程優化。以 x1、x2、x3、x4為自變量，以分離蛋白提取率為響應值Y，響應面實驗方案及結果見表3。實驗號1～24為分析實驗，25～31為7個中心實驗，用以評估實驗誤差。

表3 響應面實驗方案及實驗結果Table 3 Design and result of response surface analysis

表4 回歸與方差分析結果Table 4 Results of regression and variance analysis

2.3.2 超聲輔助提取工藝參數對黑豆蛋白提取率的響應面結果分析 通過統計分析軟件SAS9.2進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下:

Y=96.01-0.48x1+1.87x2+0.53x3+2.40x4-3.08x1x2-1.27x1x3+3.14x1x4-1.43x2x3+0.081x2x4-3.18x3x4-3.34x12-2.58x22-1.51x32-6.57x42。回歸分析與方差分析結果見表4。

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，當超聲時間為 24min，pH為 9.7，超聲功率為378.5W，液固比為10.6∶1，響應面有最優值為56.63%±0.42%。

2.3.3 驗證實驗與對比實驗 在響應面分析在響應面分析法求得的最佳條件，為了方便操作進行修定:即當超聲時間為 24min，pH為 9.7，超聲功率為380W，液固比為10.6∶1條件下，進行3次平行實驗，得到3次平行實驗黑豆蛋白提取率的平均值為56.26%，黑豆蛋白提取率的預測值為56.63% ±0.42%，說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。

2.4 超聲輔助提取對黑豆蛋白功能性影響

2.4.1 溶解性 分別測量由響應面優化實驗的到超聲輔助提取黑豆蛋白最佳參數提取得到蛋白和傳統堿溶酸沉提取出黑豆蛋白的溶解性，結果如圖5所示，由圖可見，超聲輔助提取比傳統堿溶酸沉得到的黑豆蛋白的溶解性得到明顯的提高，這是由于超聲出來可以減小黑豆蛋白的粒徑大小，增大蛋白分子與水分子的接觸機會，從而提高黑豆蛋白的溶解度［17］。

圖5 超聲輔助提取與堿溶酸沉提取黑豆蛋白溶解性Fig.5 The Solubility of ultrasonic extraction and alkali-soluble and acid precipitation of black bean protein

2.4.2 乳化性及乳化穩定性 分別測量由響應面優化實驗的到超聲輔助提取黑豆蛋白最佳參數提取得到蛋白和傳統堿溶酸沉提取出黑豆蛋白的乳化性和乳化穩定性，結果如圖6所示，由圖可見，經過超聲處理提取的黑豆蛋白的乳化性及乳化穩定性都有所提高，這是由于超聲處理使蛋白質結構展開，疏水基團暴露，疏水基團數量的增加會使蛋白更傾向于吸附在空氣/水或油/水界面，造成乳化能力的升高［18］。

圖6 超聲輔助提取與堿溶酸沉提取黑豆蛋白乳化性與乳化穩定性Fig.6 Emulsifying and emulsion stability of ultrasonic extraction and alkali-soluble and acid precipitation of black bean protein

2.4.3 起泡性及起泡穩定性 分別測量由響應面優化實驗的到超聲輔助提取黑豆蛋白最佳參數提取得到蛋白和傳統堿溶酸沉提取出黑豆蛋白的起泡性和泡沫穩定性，結果如圖7所示，由圖可見，經過超聲處理提取的黑豆蛋白的起泡性和泡沫穩定性都有所提高，這歸因于超聲處理的勻質化效應，會使蛋白和脂肪顆粒更加均勻分散［19］。

圖7 超聲輔助提取與堿溶酸沉提取黑豆蛋白起泡性與泡沫穩定性Fig.7 Foaming and foam stability of ultrasonic extraction and alkali-soluble and acid precipitation of black bean protein

3 結論

本研究利用響應面分析方法從黑豆中提取黑豆蛋白超聲處理工藝參數進行了優化，得到最優超聲處輔助提取工藝參數:超聲時間為24min，pH為9.7，超聲功率為380W，液固比為10.6∶1。經過驗證與對比實驗可知在最優超聲輔助提取工藝參數條件下黑豆蛋白提取率可達56.26%。同時超聲輔助提取出的黑豆蛋白的功能性質結果表明，經過超聲處理后的黑豆蛋白的溶解性，乳化性與乳化穩定性，起泡性和起泡穩定性都得到一定程度的提高，說明超聲輔助提取黑豆蛋白具有提取率高，節省時間，節約能源等優點，同時得到的黑豆蛋白也具備良好的功能特性。

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