響應面法優化超聲輔助提取野木瓜多酚工藝

夏 季，鄭 炯，2，3，陳光靜，王曉靜，闞建全，2，3，*

(1．西南大學食品科學學院，重慶400715;2．重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶400715;3．農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶400715)

野木瓜(Stauntonia chinensis)屬薔薇科野木瓜屬植物，果無蒂，果成熟后，香氣濃郁，在我國分布廣，資源豐富，能人工栽培，但利用率較低［1-2］。野木瓜中含有豐富的多酚類物質［3］，主要包括黃酮類、酚酸、單寧、芪類和木脂素類等物質［4］，具有抗炎、抗菌、抗癌、抗過敏、抗氧化、預防糖尿病、肥胖和心血管疾病等作用，可作為功能食品的有效成分［5-12］。相關研究表明，黃酮類物質能有效預防人和動物的增齡性認知能力衰退和神經退行性變［13］。近年來，植物多酚因其在人體健康方面的積極作用已成為研究熱點［14］，但國內外關于野木瓜的研究主要集中在野木瓜中的多糖［15-17］和皂苷成分［18-24］、野木瓜產品開發［25-26］及野木瓜的藥理作用［27］，關于野木瓜多酚的報道較少。對野木瓜中的多酚物質進行提取并用于保健食品的開發具有十分廣闊的市場前景。

超聲波提取法是利用超聲波的機械破損和空化作用，以期達到縮短浸提時間的效果，該方法具有提取溫度低、得率高、操作簡便快捷、提取物結構不易被破壞等特點，目前已廣泛應用于多種天然植物資源如茶葉［28］、葡萄［29］、石榴［30］、玉米［31］、板栗［32］、蘋果［33］中多酚的提取，但其對野木瓜多酚的提取研究尚未見報道。本實驗擬采用超聲波提取法提取野木瓜多酚，運用Folin-Ciocalteu法測定野木瓜多酚的得率，并在單因素實驗的基礎上采用響應面法優化實驗設計，得到野木瓜多酚提取的最佳工藝條件，以期為野木瓜多酚的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重慶綦江吹角村的野木瓜，粉碎后得野木瓜粉備用。石油醚、丙酮、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰(均為分析純) 成都金山化學試劑有限公司;無水碳酸鈉(分析純) 重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠;沒食子酸標準品 美國Sigma公司。

DD-5000型立式低速離心機 成都彼岸生物科技有限責任公司;DY-10-200DT型超聲波清洗器 重慶東悅儀器有限公司;HHS-24電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司;RE-5220旋轉蒸發器 重慶東悅儀器有限公司;SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津;WF130萬能粉碎機 江陰市天元藥化機械有限公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 沒食子酸標準曲線的繪制 向100mL容量瓶中精確加入沒食子酸標準品0．010g，用蒸餾水溶解并定容至 100mL。分別吸取 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL 上述標準溶液加入到10mL容量瓶中，添加1mL事先制備好的Folin-ciocalten試劑［34］，搖勻后，加入15%Na2CO3溶液2mL，用蒸餾水定容至刻度線。室溫下反應2h，于765nm 波長下測定吸光度值［35］，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1．2．2 野木瓜多酚的提取與測定 準確稱取1．0g野木瓜粉，按一定料液比加入一定體積分數的丙酮溶液后，于一定時間和溫度條件下超聲處理，然后以4000r/min離心提取液8min，收集上層清液，重復離心兩次，合并兩次離心所得上層清液，再40℃旋轉蒸發，收集殘留物并定容至25mL棕色容量瓶中待測［36］。

向10mL容量瓶中依次準確加入0．1mL待測提取液、1mL Folin-Ciocalteu 試劑、2mL 15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻后室溫下反應2h，于765nm波長下測定吸光度值，根據上述標準曲線回歸方程計算其對應的多酚質量濃度，根據下式計算多酚得率:

式中:C為待測提取液中多酚的質量濃度，mg/mL;N為稀釋倍數;V為待測提取液定容后體積，mL;m為野木瓜粉質量，g。

1．2．3 單因素實驗

1．2．3．1 超聲時間對野木瓜多酚得率的影響 固定丙酮體積分數60%，料液比1∶16，提取溫度50℃，超聲功率100W，分別采用 10、20、30、40、50min 的超聲時間提取多酚，平行實驗3次，測定多酚得率。

1．2．3．2 超聲溫度對野木瓜多酚得率的影響 固定丙酮體積分數60%，料液比1∶16，提取時間30min，超聲功率100W，分別采用40、50、60、70、80℃的超聲溫度提取多酚，平行實驗3次，測定多酚得率。

1．2．3．3 丙酮體積分數對野木瓜多酚得率的影響固定料液比1∶16，提取溫度60℃，提取時間30min，超聲功率100W，分別采用體積分數為50%、60%、70%、80%、90%的丙酮溶液提取多酚，平行實驗3次，測定多酚得率。

1．2．3．4 料液比對野木瓜多酚得率的影響 固定丙酮體積分數60%，超聲溫度60℃，超聲時間30min，超聲功率 100W，分別采用 1∶8、1∶10、1∶12、1∶16、1∶20的料液比提取多酚，平行實驗3次，測定多酚得率。

1．2．4 響應面優化實驗設計 分別以超聲時間(A)、超聲溫度(B)、丙酮體積分數(C)、料液比(D)為變量，研究單因素對野木瓜多酚得率的影響，在單因素實驗的基礎上采用Box-Behnken設計，通過響應曲面分析優化野木瓜多酚提取的工藝條件。實驗的因素水平編碼表見表1。

表1 響應面分析因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3 數據處理及統計分析

利用 Design-Expert 8．0．5 軟件進行響應面設計和分析，采用ORIGIN 8．6進行統計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

得出標準曲線方程 y=15．33x-0．0115，式中 x 為沒食子酸質量濃度(mg/mL)，y為吸光度，R2=0．9994。

2.2 單因素實驗結果與分析

2．2．1 超聲時間對野木瓜多酚得率的影響 由圖1可知，野木瓜多酚得率隨超聲時間的延長先增加后減少，在超聲提取30min時達到最大，之后降低，其原因可能是超聲時間過長使細胞內溫度升高，以及多酚暴露在空氣中時間的延長，使得多酚發生氧化、縮合、降解等反應的概率增加，導致野木瓜多酚的表觀得率下降［32，37-38］。因此，選取 30min 作為較佳超聲時間。

2．2．2 超聲溫度對野木瓜多酚得率的影響 由圖2可知，野木瓜多酚得率隨超聲溫度的升高先增加后減少，當超聲溫度升高到60℃時，野木瓜多酚得率達到最大，隨后開始下降。其原因是超聲溫度的升高加劇分子的運動，使多酚更容易滲出，但過高的溫度會破壞多酚的結構，降低野木瓜多酚的得率。因此，選取60℃為較佳提取溫度。

圖1 超聲時間對野木瓜多酚提取的影響Fig．1 Effects of extraction time on the extraction of polyphenols from Stauntonia chinensis

圖2 超聲溫度對野木瓜多酚提取的影響Fig．2 Effects of extraction temperature on the extraction of polyphenols from Stauntonia chinensis

2．2．3 丙酮體積分數對野木瓜多酚得率的影響 由圖3可以看出，隨著丙酮體積分數的增加，總酚得率先增加后減小，丙酮體積分數為60%時提取效果最佳。這是由于多酚是水溶性物質，根據相似相溶原理，提取多酚需使用與多酚極性相似的溶劑以使其充分溶出［39］。多酚在植物體內常以氫鍵的形式與蛋白質等形成穩定復合物，過低體積分數的丙酮不足以使氫鍵破壞或破壞程度不夠，導致多酚得率不高［40］;過高體積分數的丙酮使溶劑極性降低，導致多酚得率下降，并且丙酮體積分數過高會增加脂溶性物質的溶出［41］，不利于后續多酚的分離純化。因此，確定丙酮體積分數為60%。

圖3 不同體積分數的丙酮對野木瓜多酚提取的影響Fig．3 Effects of different concentrations of acetone on the extraction of polyphenols from Stauntonia chinensis

2．2．4 料液比對野木瓜多酚得率的影響 由圖4可知，隨著料液比的增加，野木瓜多酚得率增加，說明溶劑比例大有利于多酚物質的溶出。但當料液比增加到1∶16后，多酚得率基本保持不變，且料液比過大容易造成溶劑的浪費，綜合考慮多酚得率及提取成本，最終確定最優料液比為1∶16。

圖4 料液比對野木瓜多酚提取的影響Fig．4 Effects of ratio of material to liquid on the extraction of polyphenols from Stauntonia chinensis

2.3 響應面優化法確定野木瓜多酚的最佳提取條件

2．3．1 響應模型的建立與分析 實驗采用 Box-Behnken 設計，利用 Design-Expert 8．0．5 軟件分析超聲時間A、超聲溫度B、丙酮體積分數C、料液比D 4個影響因素對野木瓜多酚得率的影響，實驗設計及結果見表2。

表2 實驗設計與結果Table 2 Experiment design and the result

表3 二次響應模型方差分析Table 3 ANOVA results for response surface quadratic model

由表3方差分析可知，模型的p＜0．0001，表明該模型具有高度顯著性。失擬項p=0．1093在p＜0．05水平上差異不顯著，表明該模型具有較高擬合度，實驗誤差小，說明該模型具有實際應用意義。超聲時間(A)和料液比(D)對野木瓜多酚得率影響極顯著，二項式A2、B2、C2的p值都達到極顯著水平，D2對野木瓜多酚得率影響顯著，超聲時間是對野木瓜多酚得率影響最大的因素。野木瓜多酚得率與各因素變量的二次方程模型為:

R1=8．05200-0．32583A+0．063333B+0．057500C+0．17833D-0．025000AB+0．22000AC-0．26750AD+0．025000BC+0．28000BD+0．022500CD-0．27058A2-0．54433B2-0．33558C2-0．20183D2。

各因素之間的響應面圖如圖5所示。若響應曲面坡度趨于陡峭，表明響應值對于操作條件的改變非常敏感，若曲面坡度相對平緩，則表明操作條件的改變對響應值影響較小。響應面在底面的投影即等高線趨向橢圓且橢圓的軸線與坐標軸存在一定角度，則表明兩因素交互作用明顯，若等高線的形狀趨于圓形或橢圓的軸線與坐標軸角度較小，則表明兩因素交互作用較弱［42］。根據上述響應面的性質分析，超聲時間與丙酮體積分數、超聲時間與料液比、超聲溫度與料液比間交互顯著，其余3組間交互不顯著，與方差分析表結果一致。圖5(a)顯示，當丙酮體積分數和料液比一定時，多酚得率隨超聲時間的變化較快，超聲時間約為25min、超聲溫度約為60℃時多酚得率最大。由圖5(b)可以看出，當超聲溫度與料液比一定時，在丙酮體積分數較低的情況下，多酚得率對超聲時間的變化敏感，超聲時間為25min左右多酚得率最大。圖5(c)顯示，當超聲溫度與丙酮體積分數一定時，在超聲時間為20min的情況下，多酚得率隨料液比的增大而較快增加，料液比為1∶20時多酚得率最大，超聲時間為40min時，多酚得率隨料液比的增加變化不明顯。圖5(d)中，固定超聲時間和料液比，多酚得率隨超聲溫度和丙酮體積分數的增加先增大后減小，超聲溫度為60℃、丙酮體積分數為60%時多酚得率達到最大。由圖5(e)可以看出，固定超聲時間和丙酮體積分數，多酚得率隨超聲溫度的增加先增加后減少，超聲溫度在60～65℃范圍內多酚得率最大。圖5(f)顯示，當超聲溫度和超聲時間一定時，多酚得率隨丙酮體積分數的增加先增大后減小，但變化緩慢，料液比為1∶18、丙酮體積分數為60%左右多酚得率較大。

2．3．2 驗證實驗 根據所建立的模型進行工藝條件的優化組合，得到最佳工藝條件為超聲時間20min，超聲溫度63．3℃，丙酮體積分數58%，料液比1∶20，此時野木瓜多酚得率預測值為8．426mg/g。為了操作方便，以超聲時間20min，超聲溫度63℃，丙酮體積分數58%，料液比1∶20為工藝條件進行3次平行實驗驗證，結果顯示在該工藝條件下，野木瓜多酚得率為8．402mg/g，與上述預測值的相對誤差為0．3%，證實該模型可用于野木瓜多酚的提取。

3 結論

采用超聲輔助提取法提取野木瓜中的多酚物質，通過單因素實驗和Box-Behnken響應面實驗得到優化的工藝條件:超聲時間20min，超聲溫度63℃，丙酮體積分數58%，料液比1∶20，在最優條件下，野木瓜多酚的得率為8．402 mg/g，與預測值8．426mg/g的相對誤差為0．3%，此工藝條件可以為野木瓜多酚的工業化生產提供參考。

圖5 各兩因素交互作用對野木瓜多酚得率影響的響應面圖Fig．5 Response surface showing the pairwise interactive effects of four operating parameters on the extraction of polyphenols from Stauntonia chinensis

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