產內切菊粉酶的海洋放線菌菌株的篩選與鑒定

宮 穎，于基成，劉 秋

(大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600)

菊粉又稱菊糖，是由D-呋喃果糖分子經β-2，1糖苷鍵脫水聚合而成的線性直鏈多糖［1-2］。菊粉酶是一種催化水解菊粉中β-2，1果糖糖苷鍵的水解酶，可根據對底物作用方式的不同分為外切菊粉酶和內切菊粉酶［3］，外切菊粉酶水解菊粉用于生產高果糖漿，內切菊粉酶水解菊粉則用于生產低聚果糖［4-5］，研究表明菊粉酶的生產為微生物菌株發酵獲得［6］。目前，關于產菊粉酶微生物菌株報道較多，主要集中于曲霉屬和酵母菌屬［7-8］，也有少部分的細菌和極少的放線菌［9］。報道的各種微生物菌株的菊粉酶產量不一，酶活力一般在14.6～20.15U/mL，大多表現為外切菊粉酶活性［10］。因此獲得高效產內切菊粉酶微生物菌株具有潛在和重要的工業化應用意義。本研究目的則是從特殊生境—鴨綠江濱海濕地樣品中篩選獲得產內切菊粉酶菌株，以期獲得產高活性內切菊粉酶濕地放線菌菌株，為進一步開展產內切菊粉酶海洋微生物菌株研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

菊粉 鞍山生物技術有限公司，純度＞95%;3，5-二硝基水楊酸(DNS) 國藥集團化學試劑有限公司，化學純;L-天門冬酰胺 北京奧博星生物技術責任有限公司;瓊脂 日本進口分裝;酵母提取物 北京希凱創新科技有限公司;甘油 天津市瑞金特化學品有限公司;乙酸、乙酸鈉、K2HPO4·3H2O、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MgCl2·7H2O、ZnSO4·7H2O 均為天津市科密歐化學試劑有限公司，所有分析用試劑均為分析純;海水 取自黃海。

UV-2600紫外可見分光光度計 日本島津公司;S-4800掃描電子顯微鏡 日本日電;HYG-3多功能搖床 金壇市杰瑞爾電器有限公司;DNP-9082電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;H-1850R離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基 初篩培養基ISP5(g/L):酵母提取物5g，L- 天門冬酰胺 1g，甘油 10mL，K2HPO4·3H2O 0.01g，KNO31g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgCl2·7H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O 0.01g，瓊脂 20g，pH7.2，海水500mL，去離子水500mL，121℃高壓滅菌20min。

選擇培養基(g/L):菊粉 20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，瓊脂 20g，pH7.2，海水 500mL，去離子水 500mL，112℃高壓滅菌20min。

發酵培養基(g/L):菊粉 20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，海水500mL，去離子水500mL，112℃高壓滅菌20min。

1.2.2 菌株的篩選 取新鮮海泥樣品5.0g置于45mL無菌水中充分混勻，梯度稀釋到10-4后涂布到ISP5培養基上，28℃培養5～7d。用接種環挑取典型單菌落在以菊粉為唯一碳源的選擇培養基上分區劃線，28℃培養。

1.2.3 孢子菌懸液的制備 將菌種劃線于平板上，28℃培養3～5d，用無菌小鏟子將孢子輕輕刮下，置于無菌水中稀釋至孢子懸液濃度為10-6cfu/mL，然后以4%接種量接入發酵培養基搖瓶培養3d，采用DNS法測定其酶活性。

1.3 DNS法測定菊粉酶的活力

根據茍亞峰等人［11］和 Trivedi等人［12］報道方法并適當改良。發酵液于4℃，8000×g離心20min。取上清液1.0mL，加入4.0mL 2%菊粉溶液(0.2mol/L，pH5.0醋酸緩沖溶液配制)中，50℃反應30min。取反應液1.0mL加入1.5mL DNS混合后沸水浴5min，立即取出流水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25.0mL，混勻后靜置30min，于540nm處測定其吸光度值。取3次平行實驗平均值，根據果糖標準曲線計算樣品中還原糖含量。

菊粉酶酶活力定義為1min轉化生成1μmol還原糖所需的酶量為一個菊粉酶酶活力單位，表示為I值;同理，以4mL 2%蔗糖溶液(0.2mol/L，pH5.0醋酸緩沖溶液配制)替代菊粉溶液進行測定，以1min水解1μmol蔗糖所需的酶量為一個蔗糖酶酶活力單位，以S值表示。

由于許多微生物有菊粉酶活性的同時也伴隨著有蔗糖酶活性，通常用I/S比來描述其催化活力，因此，用I/S比值來描述酶的特征;I/S＞10時表現為內切菊粉酶活性，I/S＜10時表現為外切菊粉酶活性［13-14］。

式中，C:還原糖含量(mg/mL);t:反應時間(min);V:反應酶液體積(mL)。

1.4 果糖標準曲線的制備

依照曹澤虹等［15］報道的方法繪制果糖標準曲線。分別取果糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于25.0mL刻度試管中，以蒸餾水補足至2.0mL，再分別加入DNS溶液1.5mL，充分混勻后沸水5min，迅速流水冷卻并靜置回復至室溫，蒸餾水定容25.0mL。于540nm處測其吸光值，以果糖含量為橫坐標，以各果糖濃度對應的吸光度(Abs)為縱坐標，繪制果糖標準曲線。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 培養形態觀察 將純化的菌株接種于固體培養基平板上28℃培養2～7d觀察菌落生長特征。

1.5.2 菌絲形態觀察 將菌株接種于固體培養基上，將硅片(3mm×10mm，121℃高壓滅菌30min)45°插入平板劃線處，28℃培養5d。將硅片取出后置于25%戊二醛溶液中，于4℃冰箱中過夜固定，然后分別用40%、70%、90%和100%的乙醇脫水4次后，用醋酸正戊酯置換乙醇。鍍金處理后于電子顯微鏡下觀察。

1.5.3 構建系統進化樹 采用徐平等［16］人報道的微波法快速提取放線菌基因組DNA。設計引物進行PCR擴增，對PCR產物純化及測序，用MEGA5.0軟件進行拼接，提交到EzBioCloud網站上搜索相近菌株序列，采用MEGA5.0軟件中的CLUSTAL-W進行比對，構建系統進化樹，確定菌株的分類地位。

2 結果與討論

2.1 果糖標準曲線

圖1為果糖標準曲線，通過線性回歸分析，得到回歸方程 y=0.2058x-0.0038，其相關系數 R2=0.9996。

圖1 果糖標準曲線Fig.1 Standard curve of fructose

2.2 產內切菊粉酶菌株的篩選

以ISP5作為初篩培養基，經復篩實驗獲得產菊粉酶菌株14株，產酶活力及其酶活特征見表1。其中菊粉酶活力為3.46～28.52U/mL，有11株菌I/S＜10，表現為外切菊粉酶活性，菌株S511酶活力(7.74U/mL)最高。而菌株S502、S503和S505，I/S值均大于10，表現為內切菊粉酶活性，菊粉酶活力分別為14.13、18.24、28.52U/mL。與已報道的來源于土壤樣品中產菊粉酶的放線菌屬菌株 Streptomyces sp.CP01(1.6U/mL)［17］，Streptomyces sp.ALKC4(0.524U/mL)［13］，Streptomyces sp.GNDU 1(0.552U/mL)［18］產酶活力相比，該 3 株海洋放線菌具有較高內切菊粉酶活力。

表1 產菊粉酶活力及酶特征(n=3)Table 1 Inulinase activity and the enzyme characteristics(n=3)

2.3 產內切菊粉酶菌株形態觀察

菌株S502、S503和S505培養形態分別如圖2所示，菌絲和孢子形態分別如圖3所示。表2詳細描述了待鑒定菌株S502、S503和S505于28℃培養3d后的菌落形態特征，并在掃描電鏡下觀察其培養5d的菌絲與孢子形態特征。

表2 產內切菊粉酶菌株培養形態、菌絲和孢子形態Table 2 Culture morphology，mycelia and spore characters of the strain producing endoinulinase

2.4 系統進化樹分析

篩選獲得的產內切菊粉酶菌株S502、S503和S505，通過16S rRNA序列分析，利用MEGA5.0軟件建樹(圖4、圖5和圖6)，確定了其菌株分類地位。菌株 S502、S503、S505與 Streptomyces malachitofuscus NBRC 13059T (AB184282)、Micromonospora echinosporaATCC 15837T(U58532)、Streptomyces carpaticus NBRC 15390T(AB184641)相似度分別為99.227%、99.146%和99.859%。綜合菌株形態特征，最終將菌株S502、S503和S505鑒定為孔雀石褐鏈霉菌 Streptomycesmalachitofuscus、棘 孢小 單 孢 菌Micromonospora echinospora和鋰鏈霉菌Streptomyces carpaticus。

圖2 菌株培養形態Fig.2 The colony morphology of strain

圖3 菌株S502、S503和S505的菌絲和孢子形態Fig.3 The morphological of mycelia and spore of strain S502，S503 and S505

3 結論與討論

圖4 菌株S502系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain S502 based on 16S rRNA sequence

圖5 菌株S503系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain S503 based on 16S rRNA sequence

圖6 菌株S505系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain S505 based on 16S rRNA sequence

本研究從鴨綠江濱海濕地海泥樣品中初篩獲得14株產菊粉酶菌株，復篩獲得3株(S502、S503和S505)產內切菊粉酶放線菌菌株，其酶活力分別為14.13、18.24、28.52U/mL，且其 I/S 值分別為 19.67、29.00、15.38。經形態觀察和16S rRNA測序及構建系統進化樹分析，確定其分類地位分別為孔雀石褐鏈霉菌 Streptomyces malachitofuscus、棘孢小單孢菌Micromonospora echinospora和鋰鏈霉菌Streptomyces carpaticus。目前報道產菊粉酶的放線菌僅有鏈霉菌屬，但大多表現為外切菊粉酶活性且產酶活力較低，本文所篩選的放線菌不僅產酶活力高，而且種類不一，豐富了我國產內切菊粉酶菌株的種類。此外，這3株菌為海洋放線菌，培養基中添加了一半的海水，全球有71%的海洋區域，如果將來能作為工業酶制劑的生產原料，那么大規模的工業發酵消耗的就是大量的海水，從而節約了淡水資源，這為進一步研究3株放線菌產內切菊粉酶特性和商品綠色化生產及應用奠定了基礎。

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