交替糖蔗糖酶受體反應產低聚四糖及其條件優化

許 婷，繆 銘，張 濤，江 波

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

交替糖蔗糖酶(alternansucrase，EC2.4.1.140)最早是由 C?té［1］等發現，由腸膜明串珠菌 NRRL B-1355在蔗糖的誘導下分泌，該酶可以合成含有交替α-(1→3)，α-(1→6)糖苷鍵的葡聚糖，故 C?té等人根據此種葡聚糖的結構特征將其命名為交替糖(alternan)，而合成該糖的酶則將其命名為交替糖蔗糖酶。在對交替糖蔗糖酶進行研究時，C?té等發現，當反應體系中存在一些低分子量的受體糖分子時，交替糖蔗糖酶可以催化其合成含有交替α-(1→3)，α-(1→6)糖苷鍵的低聚糖［2］。

交替糖蔗糖酶的受體反應產生的低聚糖產物具有一些優良的特性，Maria［3］等人研究了以蔗糖和麥芽糖為底物，由交替糖蔗糖酶催化生產的麥芽糖低聚糖的益生特性，發現其能促進腸道有益菌的生長，抑制有害菌的生長，是一種良好的益生元。此外，除了可以作為益生元，這些低聚糖還可以改善食品的苦味［4］，增加某些糖類、黃酮類的溶解性［5-6］。

本實驗研究了嗜檸檬酸明串珠菌 Leuconostoc citreum SK 24.002所產的交替糖蔗糖酶，在上清及細胞膜上的分布情況，并研究了反應時間、加酶量、pH、溫度及底物濃度對該酶受體反應產低聚四糖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

菌種 嗜檸檬酸明串珠菌Leuconostoc citreum SK 24.002，為實驗室自篩菌種;蔗糖、果糖、麥芽糖、酵母粉、胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、無水氯化鈣、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸錳、硫酸鐵、抗壞血酸、醋酸鈉、冰醋酸、尿素、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、牛白蛋白、考馬斯亮藍G250、溴酚藍、β-巰基乙醇、甘氨酸等 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;TEMED、過硫酸銨 均為分析純，BBI公司。

Delta 320s型pH計 美國Metolee-toledo儀器有限公司;Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;Optima L-80XP超速離心機 美國貝克曼公司;DV-2102 PC型紫外可見分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的發酵 發酵培養基成分為(g/L):蔗糖20、酵母粉7.5、胰蛋白胨7.5、磷酸氫二鉀10、吐溫80 10、無水氯化鈣0.02、混合鹽溶液20mL/L(混合鹽成分:七水硫酸鎂0.05g/L、氯化鈉0.05g/L、一水合硫酸錳0.05g/L、七水合硫酸亞鐵 0.25g/L、抗壞血酸0.25g/L)，pH7.5。菌種接種量為 5%，接種后于30℃、160r/min的條件下培養20h。

1.2.2 酶活的分布 將培養20h后的發酵液于4℃下離心20min(8000r/min)，分別得到上清和沉淀。所得沉淀用50mmol/L pH5.4的NaAc-HAc緩沖液清洗兩遍。采用50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液溶解沉淀，并對其進行高壓破碎，將所得裂解液于4℃，10000r/min下離心30min，得到上清(S1)和沉淀(P1)。再次用50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液洗滌P1兩遍，之后用同樣的緩沖液溶解。對S1進行超高速離心，即于4℃，35000r/min的條件下離心1h，得到上清(S2)和沉淀(P2)，用 50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液洗滌P2兩遍，之后用相同的緩沖液溶解。測定各部分:發酵液、發酵液上清、發酵液沉淀、S1、P1、S2、P2的酶活及蛋白含量，具體操作見1.3.1及1.3.2。

1.2.3 細胞膜上的酶的提取 將發酵液于4℃下離心 20min(8000r/min)，用 50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液清洗沉淀兩遍，得到濕菌體。據報道，利用尿素可以提取細胞膜上的酶［7］，故采取用8mol/L尿素溶液處理菌體沉淀，具體操作為:將洗滌后的濕菌體充分混勻于8mol/L尿素溶液中，在0℃下處理1h(間接震蕩搖晃)，之后于8000r/min離心15min，取上清，將其于50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液中充分透析，所得透析后的溶液便為細胞膜上的酶的粗酶液。測定其酶活及蛋白含量，具體操作見1.3.1及1.3.2。

1.2.4 受體反應產低聚四糖的條件優化 以蔗糖為供體、麥芽糖為受體，細胞膜上的交替糖蔗糖酶為酶液，進行受體反應產低聚四糖(DP4)。研究不同加酶量、pH、溫度、底物濃度及反應時間對麥芽四糖產量的影響。

1.2.4.1 反應時間對產物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，反應體系為100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖+0.3U/mL的酶液，反應在50mmol/L pH5.4的醋酸緩沖體系中進行，反應溫度為40℃。分別于10、20、30、40、50、60min、2、3、4、5、6h 取樣，測定其DP4糖含量。各組反應重復三次。

1.2.4.2 加酶量對產物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，反應體系為:100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖+不同加酶量，加酶量分別為:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6U/mL。反應在 50mmol/L pH5.4 的醋酸緩沖體系，40℃下進行，采取最優反應時間，反應結束后對各組DP4糖含量進行測定。各組反應重復三次。

1.2.4.3 反應體系pH對產物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，在最優時間和最適加酶量的條件下，分別用 NaAc-HAc緩沖液和 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液將反應體系的pH調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件同上，反應結束后測定各組DP4糖的含量。各組反應重復三次。

1.2.4.4 反應溫度對產物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，在最優時間、最適加酶量與最適pH 的條件下，分別于 25、30、40、50、60℃ 下反應，其他條件同上，反應結束后測定各組DP4糖的含量。各組反應重復三次。

1.2.4.5 底物濃度比例對產物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，在最優時間、最適加酶量、最適pH及最適溫度的條件下，改變供體分子蔗糖與受體分子麥芽糖的比例進行反應，采取的比例(蔗糖∶麥芽糖)為:5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，其中，供體分子蔗糖的濃度為 100g/L，麥芽糖的濃度根據上述比例進行計算調整。反應結束后，測定各組酶反應產物中的DP4糖的含量。各組反應重復三次。

1.3 測定方法

1.3.1 酶活測定方法 反應體系為900μL 10%的蔗糖緩沖液+100μL酶液，反應前將底物10%的蔗糖緩沖液在40℃下保溫30min，酶液在45℃下熱處理30min［8］。反應溫度為 40℃，時間為 30min。用 DNS方法［9］測定反應液中還原糖含量。酶活定義:在40℃下，每分鐘產生1μmol果糖所需的交替糖蔗糖酶的含量。

1.3.2 蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍法，以牛白蛋白為標樣。具體操作:每1mL樣品加入5mL考馬斯亮藍試劑，充分混勻后靜置5min，在595nm下測定吸光度。

1.3.3 受體反應產物DP4糖含量的測定 利用高效液相色譜HPLC對其含量進行測定。將受體反應的反應液煮沸5min以終止反應，然后按1∶1比例加入乙醇，混合均勻后于10000r/min下離心30min，取上清，用去離子水稀釋三倍后上樣。HPLC條件:Anglent 1260;色譜柱:APS-2 Hypersil(250mm×4.6mm);流動相:75%乙腈;流速:1.0mL/min;檢測器:示差檢測器;柱溫:室溫(25℃);進樣量:10μL。受體反應的產物及DP4糖標準品的HPLC圖見2.2.2中圖2所示。

2 結果與分析

2.1 酶活分布

腸膜明串珠菌所產的交替糖蔗糖酶有部分存在于細胞膜上，而各部位的酶可以通過不同的離心速度進行提取分離［10］。將細胞裂解液在10000r/min下離心30min，所得到的沉淀P1基本為菌體碎片，所得上清S1繼續在110000×g的條件下離心得到的沉淀P2為細胞膜上蛋白，而上清S2則為可溶性蛋白。圖1為各部分比酶活大小的比較。

圖1 各部位比酶活的比較Fig.1 Comparison of alternansucrases from different parts

從圖1可以看出，各部位比酶活中，膜蛋白(P2)比酶活最大，可見由該腸膜明串珠所產的交替糖蔗糖酶主要分布在細胞膜上，而分布于上清中的酶活很低。所以在后續研究中，以細胞膜上的酶為研究對象。

2.2 受體反應產DP4糖的條件優化

2.2.1 時間對產物DP4糖含量的影響 由圖2可見，在反應前60min內，DP4產量較低，但速度較快;直至180min時，反應速度才有所降低，在此期間，DP4產量大幅增加;當時間達到300min時，DP4產量基本維持不變，可見此時反應體系已達到飽和狀態。因而，從效率的角度考慮，300min為最優的反應時間，此時體系的反應已達到穩定，且時間較短，故接下來的受體反應的反應時間都采用300min，即5h。

圖2 反應時間對產物DP4糖含量的影響Fig.2 Effects of reaction time on DP4 yield

2.2.2 加酶量對產物DP4糖含量的影響 由圖3可見，當加酶量不斷增加時，DP4糖的含量也逐漸增加，在加酶量小于0.3U/mL時，DP4的產量增加的比較明顯;當加酶量大于0.3U/mL時，雖然加酶量增加了，但是DP4的產量增加得較為緩慢，考慮到酶液的利用率，以DP4產量/加酶量為衡量標準，作為縱坐標，加酶量為橫坐標作圖，比較各種加酶量的條件下酶液的利用率。

圖3 加酶量對產物DP4含量的影響Fig.3 Effects of enzyme contents on DP4 yield

從DP4濃度/加酶量與加酶量的關系可以看出(圖4)，當加酶量為0.3U/mL時，DP4濃度/加酶量的比例最大，即此時交替糖蔗糖酶的利用率較高;當加酶量大于0.3U/mL時，DP4濃度/加酶量的比例減小，可見加酶量過大時，交替糖蔗糖酶的利用率反而降低，可能是因為此時酶過量，產生抑制作用。故在后續實驗中，采用0.3U/mL的加酶量。

圖4 DP4濃度/加酶量與加酶量的關系Fig.4 Correlation between enzyme content and DP4 yield/enzyme content

2.2.3 反應體系pH對產物DP4糖含量的影響 酶反應體系的pH會影響交替糖蔗糖酶的活性，繼而可能會影響產物DP4糖的產量，故對不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)下反應的 DP4 糖的含量進行分析。所得結果見圖5。

圖5 反應pH對產物DP4糖含量的影響Fig.5 Effects of reaction pH on DP4 yield

從圖5可以看出，pH對產物的影響還是比較大的。當pH為3時，DP4糖的產量只有5g/L，而當pH為4時，產量略有增加，達到約20g/L;當pH為5時，DP4糖的產量最大，達到43.7g/L，而pH為6時，產量略有下降;但是pH為7時，產量又急劇下降，甚至在pH為8時，DP4產量很低?？梢姰攑H在5～6間時，DP4糖的產量最大，這與上清中的交替糖蔗糖酶酶的最適pH［8］是相符合的，故在接下來的實驗中，采取pH為5.4的緩沖體系，即50mmol/L的pH5.4的NaAc-HAc緩沖液。

2.2.4 反應溫度對產物DP4糖含量的影響 反應體系的溫度會影響交替糖蔗糖酶的活性，進而影響反應產物DP4糖的含量。將相同的酶反應體系于不同的溫度下反應，測定產物DP4糖的含量，所得結果見圖6。

圖6 反應溫度對產物DP4糖含量的影響Fig.6 Effects of reaction temperature on DP4 yield

當反應溫度為25℃時，DP4糖產量約為28g/L，溫度升至30℃時，DP4糖產量大大增加，當溫度升至40℃時，DP4糖產量達到最大值，接近50g/L;當溫度繼續上升，DP4糖產量又急劇下降，當溫度升至60℃時，DP4產量甚至為零，此時酶活可能已經全部喪失。故確定最佳反應溫度為40℃。

2.2.5 底物濃度比例對產物DP4糖含量的影響 在本實驗的酶反應體系中，蔗糖為供體分子，麥芽糖為受體分子，當兩者的比例不同時，蔗糖分子作為供體分子提供葡糖基的情況，以及麥芽糖分子作為受體分子接受受體分子的情況都有可能不同。即當蔗糖與麥芽糖濃度比例不同時，受體反應的產物情況也不同，但產物大致都包括DP3糖，DP4糖和DP5糖。先采取不同的蔗糖與麥芽糖比例進行酶反應，測定產物中的各成分含量。所得結果見圖7。

圖7 底物濃度比例對產物DP4糖、DP5糖、DP6糖含量的影響(S-蔗糖;M-麥芽糖)Fig.7 Effects of substrates concentrations on DP4 yield(S-sucrose;M-maltose)

由圖7可見，蔗糖與麥芽糖濃度的比例對于受體反應的產物中DP3糖、DP4糖、DP5糖的分布影響很大。當兩者的比例大于1∶1，即供體分子蔗糖的濃度大于受體分子麥芽糖的濃度時，受體產物中DP4糖的含量比DP3糖和DP5糖都高，DP3糖和DP4糖的含量都隨著受體分子麥芽糖濃度的增加而逐漸增大，DP5糖的含量變化幅度則不大。這可能是因為在供體分子充足的情況下，除了蔗糖分子可以作為受體分子外，其受體反應產物DP3糖也可以作為受體分子，去競爭供體分子上的葡萄糖基，從而合成DP4糖;同樣的，受體反應產物DP4糖仍可以作為受體分子接受麥芽糖分子提供的葡萄糖基合成DP5糖。但是受體分子連接的葡糖基越多，其繼續競爭葡糖基的能力也會下降［11-12］，故總體上DP3的產量最大，DP4次之，DP5的產量最少。DP5糖作為受體分子的競爭葡萄糖基的能力很弱，故反應體系中幾乎不存在聚合度大于5的低聚糖了。

當供體分子蔗糖與受體分子麥芽糖的濃度比例小于1∶1，即受體分子的濃度大于供體分子的情況下，產物主要是DP3糖，DP4糖的產量也隨著受體分子的濃度的增大而減少，而DP5的產量減少的幅度更大，在蔗糖與麥芽糖兩者比例為1∶4和1∶5時，DP5產量甚至為零。這主要是由于受體分子麥芽糖的大量存在，導致供體分子相對不足，受體反應中葡糖基的轉移大部分都以麥芽糖作為受體分子，而其受體反應產物DP3只有少量的能競爭到供體分子，合成DP4糖;而DP4糖作為受體分子，由于其碳鏈比麥芽糖、DP3糖長，競爭獲取供體分子上的葡萄糖基的能力更低，而且DP4含量本身也較少，所以合成DP5糖的能力就更低，導致合成的DP5的含量非常小。

從上述結果中可以看出，在交替糖蔗糖酶的受體反應中，供體分子與受體分子的濃度比例對于產物中不同聚合度的低聚糖的分布有著較為明顯的影響。所以，在以后的研究中，可以通過對反應體系中供體分子與受體分子的濃度比例的控制，有目的的來改變產物中不同聚合度的低聚糖的含量的分布，以獲得目的產物。本課題的目標產物為DP4糖，故綜合上述分子，采用供體分子蔗糖與受體分子麥芽糖的濃度比例為1∶1。

2.2.6 受體反應產物的HPLC圖 由述實驗確定最優條件:100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖+0.3U/mL酶液，反應溫度為40℃，反應體系50mmol/L pH5.4的醋酸緩沖液的反應體系，在該條件進行受體反應，其產物的HPLC檢測結果如圖8所示，圖9為DP4標準品結果。

從圖8、圖9可以看出，在優化條件下進行的受體反應產物中，除了殘余的底物(蔗糖和麥芽糖)以及副產物果糖外，主要低聚糖為DP3糖和DP4糖。結合DP4糖標準品的HPLC圖，經計算，得出此條件下，DP4糖產量達52.8g/L，為本研究中最大產量。故確定受體反應最優條件。

3 結論

圖8 受體反應產物HPLC圖Fig.8 HPLC of receptor reactions of alernansucrase

圖9 DP4糖標準品HPLC圖Fig.9 HPLC of DP4 standard

本實驗采用的嗜檸檬酸明串珠菌Leuconostoc citreum SK24.002在蔗糖的誘導下可分泌交替糖蔗糖酶，該酶同時分泌于發酵液和菌種的細胞膜上，通過差異離心法確定了該酶的分布狀況，確定該酶主要分布在細胞膜上。該交替糖蔗糖酶可以以蔗糖為供體，麥芽糖為受體進行受體反應從而生產低聚糖，以產物中的DP4糖為指標，進行條件優化，得到最優條件為:100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖 +0.3U/mL酶液，反應溫度為40°C，反應體系50mmol/L pH5.4的醋酸緩沖液的反應體系，在此條件下，低聚四糖的產量最高可達52.8g/L。

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