真菌Aspergillus hennebergii酸性蛋白酶小麥固態發酵性能研究

黃永光，徐 巖

(1.教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學生物工程學院釀酒科學與酶技術中心，食品安全與營養協同創新中心創新團隊，江蘇無錫214122;2.釀酒科技雜志社，貴州貴陽550007)

中國傳統白酒釀造固態發酵與其他發酵方式不一樣，屬于多菌種的多維自發調控共酵的多邊發酵方式［1］。整個發酵過程，主要是通過微生態變化與釀造底物物態變化之間的共同調節，推進固態發酵和實現優質高產［2］。傳統名優白酒釀造固態發酵原料一般為谷物原料，特別是制曲原料所用的小麥含有較高的蛋白質，在釀造過程必須通過外加條件進行催化降解，如添加生物酶，改變發酵環境的酸度、溫度等發酵條件參數來促進蛋白質的水降，將蛋白質轉化成小肽、氨基酸等小分子參與生物代謝、促進微生物生長、增加酒體風味等［3］。

在固態發酵釀造過程主導性酶為淀粉酶、糖化酶、蛋白酶。其過程酸性蛋白酶的應用可實現多維協同性的調控作用，如溶解發酵原料顆粒促進糖化發酵;分解蛋白質原料為微生物繁殖提供營養型小肽、氨基氮，供給微生物生長所需的營養源;積累氨基酸可促進氨基酸代謝，豐富、改善酒體中的風味物質;提高乙醇濃度等。因此，固態發酵產酸性蛋白酶功能菌及其分泌酸性蛋白酶在固態發酵過程發揮了巨大的功能作用，愈來愈受到研究者和行業的重視［3］。目前，固態發酵法釀造白酒過程產酸性蛋白酶的微生物主要為霉菌，主要菌株有黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、泡盛酒曲霉(Aspergillusawamori)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、根霉(Rhizopus spp)等以及變異株、突變株［4］。商品型酸性蛋白酶生產菌主要為黑曲霉和宇佐美曲霉菌株。在曲霉產酸性蛋白酶方面研究也比較多，如Fei等人［5］對黑曲霉變異菌株6042酸性蛋白酶的性質進行了系統研究。

Aspergillus hennebergii是從醬香型白酒釀造過程分離獲得的真菌［3］。目前，有關A.hennebergii酸性蛋白酶及其在固態發酵過程的研究尚未見相關報道。本文以小麥為原料，主要研究A.hennebergii產酸性蛋白酶對小麥固態發酵性能的影響，包括:添加酸性蛋白酶對釀酒酵母生物量的影響;對原料蛋白的水解情況;對發酵醅氨基酸態氮含量變化的影響;對乙醇濃度的影響等。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥:采集于貴州茅臺鎮原產地小麥，水分11.47%，淀粉 64.32%，支鏈淀粉 54.8%，蛋白質 13.55%［6］。

菌株:A.hennebergii［3］、Saccharomyces cerevisiae［6］，均分離于醬香型白酒釀造過程。

酸性蛋白酶:絲狀真菌A.hennebergii產酸性蛋白酶，實驗室分離純化獲得，酶活為120U/mL。

3，5-二硝基水楊酸、三氯乙酸、酪素、福林酚等試劑，均為分析純，購于中國醫藥集團上海化學試劑公司。

PB2002-N稱量天平 瑞士Mettler-Toledo公司;高壓蒸汽SS325全自動滅菌鍋 日本Tomy公司;無菌超凈工作臺 蘇州凈化設備廠;生化恒溫培養箱HX-9080B-2 上海福碼實驗設備有限公司;高速冷凍離心機Avanti J-E 美國Beckman Coulter公司;酶標儀 美國Thermo公司;氨基酸分析液相色譜儀 美國安捷倫公司;Waters 600型高效液相色譜儀 美國Waters公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 新鮮干燥小麥，粉碎成小麥粉，取過80目篩比例為60%的混合麥粉。

1.2.2 固態發酵條件 準確稱取50g粉碎原料于500mL三角瓶中，加蒸餾水調水分達到48%，拌勻，121℃、0.1MPa滅菌 20min。冷卻至 30～35℃，接入2.0mL S.cerevisiae菌懸液(1.0×107spores/mL)。同時，按20U/g發酵醅加入A.hennebergii酸性蛋白酶。拌勻后置于30℃恒溫培養1～7d。發酵過程每隔24h取樣測定相關指標。以不加酸性蛋白酶作為空白對照樣。每個樣做三個重復平行實驗。

1.2.3 分析方法 生物量測定:采取活菌平板計數法。

乙醇濃度測定:參考文獻［7］。

游離氨基酸測定:采用色譜法［8］。

還原糖測定:采用 DNS 法［9］。

總酸測定:參考Li等人的方法［10］。總酸分析用0.1mol/L NaOH標準溶液滴定，以乳酸計。

水解度(DH)分析:取發酵4d的發酵醅進行水解度分析，水解度的測定采用pH-stat法［11］，水解產物分子量分析參考Liu等人的方法［12］。

1.2.4 數據處理方法 數據統計采用SPSS 15.0進行ANOVA單因素方差分析及Ducan多重檢驗(p＜0.05)，數值以平均值±標準偏差標示。

2 結果與討論

2.1 S.cerevisiae生物量變化

真菌酸性蛋白酶在發酵過程對S.cerevisiae的變化具有正向調控作用［6，13］，特別是對蛋白酶分泌缺陷型S.cerevisiae菌株的純種發酵或高濃度發酵，外加蛋白酶對緩解營養缺陷限制和發酵環境脅迫條件約束、縮短延遲期、提高S.cerevisiae生物量、延緩酵母衰退、延續發酵都具有很重要的意義。圖1為本實驗中S.cerevisiae小麥固態發酵過程添加A.hennebergii酸性蛋白酶對其生物量的影響結果。

圖1 酸性蛋白酶對發酵醅中酵母生物量的影響Fig.1 Effect of acid protease on the yeast biomass of fermented grains

從圖1可看出，發酵過程S.cerevisiae的變化趨勢呈現先快速增加，后緩慢遞增到平緩，最后逐漸降低的趨勢。與空白對照比較，添加生物酸性蛋白酶能明顯加速細胞生長，促進S.cerevisiae的繁殖，使細胞生物量較快的達到峰值，細胞生長速率增加，同時在生物量達到峰值期后能延緩細胞衰退，延長S.cerevisiae發酵期。由此可見，A.hennebergii酸性蛋白酶的添加可以實現S.cerevisiae發酵的正向調控，發酵過程S.cerevisiae生物量提高達37.09%。

S.cerevisiae在發酵過程的主要功能是代謝積累乙醇和酯化生香提供風味成分，其前提都需要提供氮源及能量，確保S.cerevisiae的活性和生物量的增加，特別是在不外加營養源的固態發酵過程，其生長過程所需氮源的獲取及其攝入尤其顯得困難，必須通過參與發酵的微生物自身分泌蛋白酶對其發酵底物進行水解來提供營養型氮源。正如本固態發酵過程S.cerevisiae的明顯增長主要靠添加A.hennebergii酸性蛋白酶促進小麥蛋白水解不斷提供氨基氮源。這與 Kolothe 等人［14］的研究結果一致;Atisom 等人［15］的研究也取得了同樣的效果。細胞延遲期的縮短主要原因在于處于不利發酵環境條件下的細胞能很快從環境中攝取氨基酸，增加細胞內氨基酸濃度，從而增加細胞活性和對不利環境脅迫因子的耐受性。發酵過程，氨基酸的攝入也一定程度改變了細胞內與氨基酸代謝和氨基酸轉運關聯蛋白表達量的上調，蛋白表達量的增加導致細胞內蛋白合成速率加快［16］，使其更有利于細胞在延遲期的活性恢復和生長，實現生物量的增加。

2.2 乙醇濃度的變化

發酵的最終目標之一是提高發酵醅乙醇濃度，因此發酵醅乙醇濃度也是衡量發酵是否正常和高效的指標。本實驗研究過程通過分析比較對照樣和添加生物酸性蛋白酶對發酵醅乙醇濃度的影響，來考察A.hennebergii酸性蛋白酶對S.cerevisiae小麥固態發酵質量的影響，其結果見圖2。

圖2 酸性蛋白酶對發酵醅乙醇含量的影響Fig.2 Effect of acid protease on the ethanol content of fermented grains

圖2結果表明，隨著發酵時間的延長，在24h后發酵醅的乙醇濃度呈快速的增加，到60h后增速放緩。總體結果表明，添加酸性蛋白酶有利于S.cerevisiae代謝乙醇的積累，提高發酵醅乙醇濃度達38.29%。該結果與A.hennebergii酸性蛋白酶自身的性質有關，如pH特性、酶活性質與環境脅迫條件的適應性、蛋白酶結構等［3］;這些都是影響發酵過程S.cerevisiae代謝乙醇的關鍵因素。從圖2還可以看出，在72h后發酵醅酒精濃度不再大幅度增加，基本穩定在一定范圍內，到第5d后趨于逐漸降低，主要原因可能在于發酵初期時發酵醅中含有一定量的氧氣，同時添加酸性蛋白酶水解蛋白質為S.cerevisiae的生長提供氮源，促進S.cerevisiae的快速繁殖，為增加發酵強度提供了前提，致使發酵醅的乙醇濃度得以提高。隨著發酵醅中氧氣的耗盡，S.cerevisiae厭氧發酵實現乙醇的積累，發酵醅乙醇濃度迅速提高對S.cerevisiae和酶形成產物抑制，發酵醅中的酸性蛋白酶和其他酶系的酶活性降低，導致發酵逐步衰退［17-18］，乙醇積累降低。還有部分乙醇也參與了酯類等物質的合成，一定程度上也有所降低。此時，發酵后期的發酵強度和發酵質量取決于乙醇的積累速度，S.cerevisiae的乙醇耐受性、酸性蛋白酶的乙醇耐受性，如后者的作用強度大于前者，發酵繼續趨向乙醇積累的方向，如弱于后者發酵逐漸偏離正常狀態，發酵質量隨發酵時間的延長而降低，氮源供給效率逐漸弱化，發酵醅中酵母活性降低，逐漸衰老或死亡，故乙醇量基本不再增加。

發酵過程乙醇的代謝積累與細胞的生物量有關。在本研究過程發酵醅生物量的增加為厭氧發酵積累代謝乙醇起到基礎性的作用。同時，添加酸性蛋白酶增加氨基酸，促進了細胞內氨基酸濃度的增加，引起參與乙醇代謝途徑相關的蛋白表達量的上調，特別是乙醇脫氫酶Adh1p和Adh4p的高表達，還有Act1p蛋白表達的上調也給予了極大的貢獻［19-21］，導致乙醇的不斷積累。

2.3 氨基酸態氮含量變化

在S.cerevisiae固態發酵過程，氮源是主要的營養物質和氨基酸代謝產風味物質的調控因子。其來源主要有兩方面，一是釀造原料中的蛋白在蛋白酶的作用下最終水解為氨基酸，這類氮源在外加蛋白酶后或菌株生長過程隨分泌蛋白酶的產生就開始積累和發揮功能作用;二是來源于發酵過程S.cerevisiae死亡后其菌體蛋白的蛋白酶水解產物氨基酸不斷進入發酵醅中，這類氮源的增加主要發生在菌體生長的衰亡期后。因此，要實現發酵的經濟效益化，整個發酵過程從S.cerevisiae的生物量而言在其生長延遲期、對數期和穩定期提供氮源最為重要。在延遲期提供氮源，可以恢復細胞活性，促進S.cerevisiae生長，縮短延遲期，但從發酵產率、發酵質量來講，則對整個發酵過程進行有序的控制、調節更為重要，因為傳統白酒釀造固態發酵期比較長，產率要求較高，風味質量要求較高，因此必須對整個過程進行協調性的調控，而且是多邊調控，包括生物量、酶活、乙醇濃度、風味成分種類及其含量等等，這樣才能提高發酵質量和生產率，發揮酶的最大功效。添加生物酸性蛋白酶對發酵醅氨基酸的影響結果見圖3。

圖3 酸性蛋白酶對發酵醅氨基酸態氮含量的影響Fig.3 Effect of acidic protease on the amino nitrogen content of fermented grains

由圖3可知，發酵醅氨基酸態氮含量的變化與添加酸性蛋白酶密切相關。發酵醅氨基酸態氮呈緩慢增加，但含量不高可能是由于發酵醅中酸性蛋白酶活性不夠或添加量不夠使得氨基酸態氮增加緩慢，最終氨基酸態氮含量提高為34.21%。小麥中含有13%左右的蛋白，發酵過程蛋白不斷被A.hennebergii酸性蛋白酶水解，生成小肽和氨基酸被酵母利用，進入細胞和參與生化代謝途徑;另一方面蛋白酶水解可破壞原料顆粒間質細胞壁的結構［22］，更利于發酵過程酶的作用，提高發酵質量。蛋白酶的性質不同對小麥蛋白水解效果也存在明顯差異。研究表明，堿性蛋白酶酶解小麥蛋白后氨基酸的總量變化較小(總量提高8.03%);而酸性蛋白酶酶解產物中氨基酸總量提高達到21.09%，酸性蛋白酶水解可明顯提高小麥蛋白的溶解度［17］。對小麥蛋白水解物的研究結果還表明，堿性蛋白酶酶解前后呈顯著差異的氨基酸為蛋氨酸，胱氨酸、色氨酸;酸性蛋白酶酶解前后呈顯著差異的氨基酸為酪氨酸，胱氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸和丙氨酸［23］，酸性蛋白酶水解產物多為風味型及風味代謝型氨基酸。

2.4 還原糖的變化

小麥含豐富的淀粉，可用于制曲、釀酒、制醋、制醬等，為參與發酵的微生物生長提供碳源和為可發酵型糖的轉化提供底物。釀造過程發酵正常與否、發酵效率高低不但可以通過發酵醅乙醇濃度來衡量，而且還可以直接體現在還原糖等指標的變化上。由于小麥淀粉較易水解為還原糖，還原糖被S.cerevisiae利用的速率取決于酵母的生物量，S.cerevisiae的生物量一定程度上也決定于發酵醅中的氨基酸的濃度和種類。因此，發酵過程還原糖消耗速率快，最終殘糖就低，乙醇濃度則高，都是高質量發酵的期望。添加A.hennebergii酸性蛋白酶對固態發酵醅還原糖變化影響的結果見圖4。

圖4 酸性蛋白酶對發酵醅還原糖含量的影響Fig.4 Effect of acid protease on the reducing sugar content of fermented grains

在本研究過程，還原糖的變化主要決定于添加的真菌酸性蛋白酶和S.cerevisiae分泌酶的共同作用。圖4結果表明，生物酸性蛋白酶的添加，導致發酵醅的還原糖變化較明顯。在前期酵母主要處于生長過程，對還原糖利用較低，通過酶作用淀粉并積累還原糖，使其含量快速增加。隨著酵母進入厭氧發酵，還原糖被S.cerevisiae利用轉化為乙醇，含量逐漸降低。最后因營養限制、S.cerevisiae衰老和產物抑制，S.cerevisiae生物量降低，淀粉轉化的糖分基本不再被利用，從而基本得到穩定。但也可以看出，在添加酸性蛋白酶后，可加速淀粉向還原糖的轉化，繼續為S.cerevisiae發酵提供前體，有利于發酵度的提高。

2.5 總酸的變化

發酵過程，原料降解、S.cerevisiae代謝、酶解等方式均可以將淀粉等大分子物質轉化為有機酸，如乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸等，改變發酵體系的酸性環境。圖5為添加酸性蛋白酶對小麥S.cerevisiae發酵過程發酵醅酸度變化的影響結果。

圖5 酸性蛋白酶對發酵醅酸度的影響Fig.5 Effect of acid protease on the acidity of fermented grains

如圖5所示，從24h開始，發酵醅總酸含量逐漸上升，到96h左右發酵達到頂點，隨后逐漸下降，最后趨于基本穩定。添加酸性蛋白酶的發酵醅總酸變化結果明顯高于對照發酵醅，這可能是因為添加酸性蛋白酶促進了小麥蛋白最終水解產物氨基酸的積累和由于相應生物量的增加及其代謝強度增加對發酵醅中呈酸物質的貢獻，致使發酵醅酸度增加，最終發酵醅總酸提高達36.17%。發酵后期，總酸的下降，與發酵過程產生的有機酸及參與微生物代謝和其他生化反應有關，比如與醇生成酯，形成香味成分等。

2.6 蛋白水解度變化

小麥蛋白主要為麥谷蛋白和麥醇溶蛋白，在中性條件下，溶解性極小，在越偏離中性時，溶解性較好［22-24］。在發酵過程，其水解度直接影響到為S.cerevisiae提供營養和生長因子的程度，水解度越高，蛋白最終水解產物氨基酸量越高，越對S.cerevisiae生長有利。圖6為發酵不同時期小麥蛋白水解度的分析結果;表1為添加酸性蛋白酶對發酵96h后小麥蛋白水解產物分子量的影響結果。

圖6 酸性蛋白酶對發酵醅蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of acid protease on the hydrolysis degree of fermented grains protein

高水解度有利于提高水解產物中的小分子肽和氨基酸的含量。如圖6所示，24h后，小麥蛋白開始快速水解，隨著發酵時間的推移，水解度逐漸增加，到72h后才趨于平衡。與對照樣比較，添加酸性蛋白酶能明顯促進小麥蛋白的水解，這也與S.cerevisiae生物量、乙醇產量、氨基酸態氮含量變化結果趨勢一致。圖2結果表明，72h后乙醇積累達到峰值，雖然酶活會受到乙醇的產物抑制影響，可能會影響蛋白水解能力衰減，但乙醇的積累同樣為醇溶蛋白的水解提供了條件，增加醇溶蛋白的溶解性，因此水解仍然繼續進行，特別是前期水解產物小分子蛋白或小肽段繼續進一步水解產生氨基酸。因此，圖6中水解度仍然呈現增加態勢。最后，隨發酵時間的延長，酶逐漸被消耗，活性降低，與酶作用的肽鍵逐漸減少，水解反應趨于停滯。另外，酶的產物抑制也隨發酵時間的延長更加明顯。

表1 發酵96h后發酵醅蛋白水解產物的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of fermented grains protein hydrolyzate

發酵過程小麥蛋白水解產物(表1)結果表明，三種發酵條件的蛋白水解效果存在明顯差異，水解效果最好的還是添加生物酸性蛋白酶的發酵醅。圖6結果表明，隨著發酵時間的延長，小麥蛋白水解度不斷增加，大分子蛋白逐漸被水解成小肽(表1)。而且水解產物主要集中在小分子量區間，而且300u以下的小肽占有較高的比例，說明添加A.hennebergii酸性蛋白酶能將小麥蛋白水解成小分子小肽，并進一步被水解成氨基酸，提供發酵微生物利用和促進生物代謝，提高發酵體系的質量。總體來看，添加酸性蛋白酶可使小麥固態發酵中蛋白水解度提高28.26%，300u以下小麥蛋白水解產物提高達14.1%。

3 結論

傳統固態法白酒釀造過程及發酵環境極其復雜，涉及多菌系、多酶系、多物系、多變性的多維多邊發酵系統，存在著產酒與生香的矛盾，釀造發酵過程既要創造條件促進微生物的生長繁殖，實現自然調控與演替，又要限制發酵條件保障發酵進程正常產酒與生香。因此，在發酵過程必須要滿足和實現各多維系統之間的協同性，才能實現發酵正常化和高產多效，不然會導致發酵異常。在整個酸性發酵環境下，酸性蛋白酶對發酵體系中的蛋白水解、微生物生長和風味成分的形成與調控起著舉足輕重的作用，既要實現對發酵底物蛋白進行水解，提供小肽、氨基酸等，為微生物生長提供氮源，保障發酵過程的生物學動力;同時氨基酸等參與細胞生化反應，進行氨基酸代謝，促進酒體風味成分的形成;酸性蛋白酶又要接受發酵積累的產物抑制和環境脅迫條件抑制。本研究結果表明，添加生物酸性蛋白酶除了強化小麥蛋白水解，為S.cerevisiae生長提供氨基酸等營養外，還能促進生物量的增加;氨基酸在酶和S.cerevisiae的作用下進一步生成醇、酯、酚等物質;同時氨基酸的增加，可促進芳香族氨基酸代謝，產生更多的風味成分，賦予白酒特有的香氣［3］。如可促進甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等代謝，產生更多的酸、醛、酮、酯、吡嗪類等風味物質;生物酸性蛋白酶的添加可以進一步改善發酵質量;提高乙醇產率。

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