影響枯草芽孢桿菌B-1發酵南極磷蝦殼的因素研究

陳雪姣，姜啟興，許艷順，劉富俊，肖成立，許兆濱，夏文水，*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2.遼寧省大連海洋漁業集團公司，遼寧大連116113)

南極磷蝦(Euphausia superba)，又名大磷蝦或南極大磷蝦。南極磷蝦的生物量為6.5～10億噸［1］，資源蘊藏量巨大，是可供人類利用的海洋動物資源中蘊藏量最為豐富的一種，也是人類重要的后備蛋白庫［2］，除富含蛋白外，還含有人體所必需的全部氨基酸，富含亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質元素，且類胡蘿卜素色素含量高［3-4］。目前，國內研究更多關注南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應用［5］，國外則側重于對酶、脂肪酸等的分離純化及其性質分析［6-7］，對磷蝦殼資源的研究較少。蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開發利用，例如甲殼素。

目前利用蝦殼廢棄物制備甲殼素的技術存在明顯不足:如一般采用強酸(HCl)脫鈣和強堿(NaOH)脫蛋白，不僅這兩種化學品對甲殼素的分子鏈都有一定的破壞，能耗高，廢棄物對環境污染較嚴重，而且其中的蛋白、鈣質等礦物質均作為雜質被除去，無法回收［8］。國外已有利用微生物發酵，對蝦蟹等廢棄物進行生物發酵制備甲殼素的研究，Zakaria［9］使用副干酪乳桿菌發酵蝦殼，蛋白質去除率為77.5%。Jung［10］使用了副干酪乳桿菌發酵蟹殼，5d后使用另外一株靈桿菌繼續發酵，最終脫蛋白率達到52%。該技術與傳統的酸堿法相較反應更溫和、甲殼素結構更穩定，成本低、是一種節能環保的清潔生產方法，發酵殘渣即為粗甲殼素，經簡單處理即可得到食用級甲殼素，可以實現對資源全面有效的利用，并且易于實現工業化生產［11］。

基于上述背景，本研究以篩選出的高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌B-1水解磷蝦加工下腳料中的蛋白質，研究發酵過程中枯草芽孢桿菌B-1產蛋白酶活力的變化，同時優化發酵脫蛋白條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦(Euphausia superb) 遼寧省大連海洋漁業集團公司提供，于-18℃凍藏，冷凍南極磷蝦自然解凍，經采肉機采肉三次后得南極磷蝦殼，于-18℃凍藏備用;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 江南大學生物工程學院發酵實驗室保藏菌種，活化后備用。

JB 5374-91電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多(上海)有限公司;YCR-180采肉機 上海華夏漁業機械儀器工貿公司;501型超級恒溫器 上海市實驗儀器廠;90-2恒溫磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠;UV1000紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;4K-15高速冷凍離心機 Sigma公司;THZ-D恒溫振蕩器 太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 外加碳源對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蝦殼蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比1∶3，接種量 6%(1 ×108cfu/mL)，37℃下120r/min搖床發酵36h，以不添加碳源為對照，分別添加葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉作為碳源，添加量均為10%;測定發酵液蛋白酶活力及蝦殼蛋白去除率，每個樣品平行3次。

1.2.2 發酵時間對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比1∶3，接種量6%，37℃下搖床發酵，轉速 120r/min，每隔12h取樣測定，每個樣品平行3次。

1.2.3 料液比對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL容量的玻璃瓶中，料液比分別為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 接種量 6%，37℃下轉速120r/min搖床發酵36h，每個樣品平行3次。

1.2.4 接種量對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL玻璃瓶中，接種量分別 1%、2%、4%、6%、8%，料液比 1∶3，37℃ 下120r/min搖床發酵36h，每個樣品平行3次。

1.2.5 發酵溫度對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比 1∶3，接種量 4%，分別于 30、35、37、40 和 45℃下搖床發酵36h，轉速120r/min，每個樣品平行3次。

1.2.6 轉速對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比1∶3，接種量4%，37℃下搖床發酵36h，轉速分別為0、60、120、180、240、300r/min，每個樣品平行3 次。

1.2.7 起始pH對枯草芽孢桿菌發酵蝦殼產酶活力和蛋白去除率的影響 分別準確稱取25g南極磷蝦殼經121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，起始 pH 分別為6.5、7.5、8.5、9.5 和 10.5，料液比 1∶3，接種量4%，120r/min搖床發酵36h，每個樣品平行3次。

1.2.8 發酵工藝條件的優化 在單因素實驗結果的基礎上選擇因素水平，外加碳源、轉速、起始pH對枯草芽孢桿菌產酶活力和蝦殼蛋白去除率的影響不大，而料液比過大對發酵液中的蛋白質回收不利，料液比過小影響溶氧量和酶活，故選取發酵時間、發酵溫度、接種量三因素，以蛋白去除率為指標，采用L9(33)正交實驗進行發酵工藝條件優化。實驗因素水平見表1。

表1 發酵脫蛋白正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test of deproteinization by fermentation

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白酶活力的測定 紫外分光光度法(QB/T1803-1993蛋白酶)。以L-酪氨酸濃度為橫坐標，吸光值A275為縱坐標，得到L-酪氨酸標準曲線:以酪氨酸為標準物的工作曲線回歸方程為:y=0.0075x-0.0058，相關系數 R2=0.999。

1.3.2 蛋白質去除率的測定 蛋白質去除率的測定參照 Aytekin［12］，按照以下公式計算:

蛋白質去除率(%)=(原料中總蛋白質量-濾渣中蛋白質量)/原料中總蛋白質量×100

1.4 數據處理

數據分析采用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)軟件;數據繪圖采用 Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同單因素對發酵產中性蛋白酶及蛋白去除率的影響

2.1.1 碳源對產酶活力和蛋白去除率的影響 不同的碳源對枯草芽孢桿菌產酶的影響和蛋白去除率結果見圖1。

從圖1可以看出，與不添加碳源的對照組相比較，添加葡萄糖等碳源的發酵組，其蛋白酶活力略有增加，但在幾種糖之間無顯著差異。而添加水溶性淀粉組對酶活影響反而無益，對枯草芽孢桿菌的生長無影響，產酶也沒有較大的提高，產生這種現象的原因有可能是由于南極磷蝦加工下腳料本身即可作為碳源氮源，且富含 Zn、Fe、Cu、Mn 等微量元素，Na、K、Ca、P、Mg 等常量元素［13］，均可作為枯草芽孢桿菌的生長因子，綜上考慮及成本的控制，下面的實驗均不另外加入碳源。

圖1 碳源的選擇對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.1 Effect of different carbon source on proteolytic activity and DP rate by Bacillus subtilis B-1

2.1.2 發酵時間對產酶活力和蛋白去除率的影響測定了不同發酵時間對蛋白酶的活力以及蛋白去除率，結果見圖2。

圖2 發酵時間對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

從圖2可以看出，在12～36h內，蛋白酶活力呈上升趨勢，在36h蛋白酶活力最高，達到1550U/mL，產生這種現象的原因可能是由于發酵初始，南極磷蝦加工下腳料提供氮源，枯草芽孢桿菌在12～36h之間由對數期達到穩定期，在這期間產酶活性趨于增加，但是當發酵時間由36～72h時，菌種由穩定期向衰亡期過渡，蛋白酶活力也隨之下降，但是由于蛋白酶的持續水解作用，蝦殼的蛋白去除率則隨著發酵時間的增加逐漸升高。

2.1.3 料液比對產酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同料液比下枯草芽孢桿菌的產酶活力及蛋白去除率，結果見圖3。

圖3 料液比對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

由圖3表明，在發酵過程中，不同的料液比，發酵液的產酶活力也不同，最適宜料液比為1∶3，此時的蛋白酶活力及蛋白去除率都達到最高。可能料液比不同，對溶氧量有一定的影響，枯草芽孢桿菌是需氧菌，低溶氧不利于產酶［14］。

2.1.4 接種量對產酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同接種量對枯草芽孢桿菌的產酶活力和蛋白去除率的影響，結果見圖4。

圖4 接種量對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.4 Effect of different inoculum quanity on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

由圖4表明，接種的枯草芽孢桿菌越多，發酵液的產酶活力和蝦殼的蛋白去除率呈現總體增加的趨勢，到4%以后趨于平穩;產生這種現象可能是當接種量增大到一定量時，菌種因為生長導致代謝產物的累積及營養的消耗，抑制了菌體的產酶速率。

2.1.5 發酵溫度對產酶活力和蛋白去除率的影響研究了不同的發酵溫度對產酶活力和蛋白去除率的影響，結果見圖5。

圖5 發酵溫度對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

圖5表明，隨著發酵溫度的升高，發酵液的產酶活力先升高后降低，最優發酵溫度為37℃，此時產酶活力為1560U/mL，溫度過低不利于菌體的生長及代謝產酶，溫度過高，菌體易衰老而影響其正常生長和代謝。

2.1.6 轉速對產酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同轉速對產酶活力和蛋白去除率的影響，結果見圖6。由圖6可知，轉速為120r/min時蛋白酶活力最大，轉速由0～120r/min之間，隨著轉速的增大，蛋白酶活力增大，說明轉速增大，溶氧增大，有利于產酶;當轉速大于120r/min時蛋白酶活力不再升高，可能是轉速繼續增大，對枯草芽孢桿菌本身有損害，從而使蛋白酶活力降低。

圖6 轉速對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.6 Effect of rotate speed on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

2.1.7 起始pH對產酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同起始pH對產酶活力和蛋白去除率的影響，結果見圖7。由圖7表明，最優pH為8.5，接近于蝦殼自身的pH，此時蛋白酶活力為1590U/mL，pH降低或者升高，蛋白酶活力均降低，說明弱酸及弱堿環境均不利于菌株產酶。所以在后續實驗中為了考慮人力成本及實驗效果，發酵起始pH則使用蝦殼自身的pH即可。

圖7 起始pH對產酶活力和蛋白去除率的影響Fig.7 Effect of different initial pH on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

根據單因素實驗結果，不外加碳源，轉速選擇120r/min，起始pH選擇蝦殼自身pH，考慮到枯草芽孢桿菌是需氧菌及發酵液的溶氧量，料液比選擇1∶3，對發酵周期、發酵溫度和接種量三因素的正交實驗水平選擇在48～72h，35～40℃和2%～6%的范圍內。

2.2 發酵條件的正交優化

以蛋白去除率為指標，對發酵周期、發酵溫度和接種量進行三因素三水平的正交實驗。正交實驗結果如表2所示。

根據表2中極差分析可以看出，影響枯草芽孢桿菌B-1發酵蝦殼的蛋白脫除率因素主次順序為A＞C＞B，即發酵周期為主要因素，其次是接種量、發酵溫度;最佳發酵條件為A3B2C2，即發酵時間72h，發酵溫度37℃，接種量為4%。為驗證該優化的效果，進行了兩次重復驗證實驗，結果蛋白去除率分別為:87.5%、90.3%，平均值為88.9%，高于正交最高值85.30%，說明實驗結果可靠，此時在最優參數下，發酵液中的酶活力為1670U/mL。

表2 正交實驗安排及結果分析Table 2 Orthogonal test arrangement and the result analysis

3 結論

在單因素實驗(料液比1∶3、轉速120r/min、蝦殼自身pH)的基礎上，通過發酵條件正交實驗探明了影響發酵南極磷蝦脫蛋白效果的另外三種主要因素影響順序為:發酵周期對蛋白去除率影響最大，發酵溫度次之，接種量影響最小。優化后的發酵工藝條件為:發酵時間72h，發酵溫度37℃，接種量為4%，料液比1∶3。在此條件下進行發酵，蛋白去除率可達88.9%左右，可以作為南極磷蝦生物發酵制備甲殼素的參考條件。到目前為止，所有發酵相關的研究都旨在評價生物處理的脫礦物質和脫蛋白效果，在此研究之前，Jo等［15］篩選 Serratia marcescens FS-3 發酵蟹殼，發酵7d后蛋白質去除率為84%，不同的微生物自身產蛋白酶的能力不一樣，本研究中枯草芽孢桿菌高效的蛋白去除率和更短的發酵周期使得微生物發酵提取甲殼素這種節能環保的生產技術有了更大的進步。未來需要進一步解決的是規模擴大的技術問題，真正實現微生物發酵提取甲殼素的工業生產。

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