伽馬射線輻照對(duì)紅豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響

李 楊，王 晶，陳 勇，馬文君，王中江，王 瑞，畢 爽，江連洲，2，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

紅豆(Phaseolus angularis)菜豆屬，豆科，俗稱“赤小豆”、“紅豆”、“赤豆”、“紅小豆”、“小豆”［1］。紅豆中蛋白質(zhì)含量平均為25.2%，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源，營(yíng)養(yǎng)分析顯示紅豆的氨基酸種類齊全，必需氨基酸水平達(dá)到甚至高于FAO/WHO的要求［2］。紅豆蛋白作為豆類蛋白，它具有和大豆分離蛋白許多相似的蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性，如溶解性，乳化性，起泡性等。但紅豆蛋白在我國(guó)利用率相對(duì)較低，是一種潛在的質(zhì)優(yōu)豆類蛋白資源［3］。隨著人們生活水平的提高和健康意識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)紅豆蛋白資源開發(fā)和綜合利用研究已逐步發(fā)展起來，這對(duì)于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)具有重要意義［4］。

輻照技術(shù)，是借助鈷-60所產(chǎn)生的高能量、強(qiáng)穿透性的伽馬射線，電離和激發(fā)物質(zhì)產(chǎn)生的活化分子與活化原子，并發(fā)生一系列物理、化學(xué)、與生物化學(xué)變化，使物質(zhì)發(fā)生聚合、交聯(lián)、降解、并發(fā)生改性［5］。在食品方面，國(guó)際輻照食品聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFI)，審閱并核實(shí)了大量國(guó)際研究資料后，在1980年得出“以貯存為目的，任何食品受到10kGy以下的輻照，沒有毒理學(xué)危險(xiǎn)，在營(yíng)養(yǎng)學(xué)和微生物學(xué)上也是安全的”的結(jié)論［6］。近年來，我國(guó)逐步加快了輻照技術(shù)在食品中的應(yīng)用研究，羅春萍［7］通過研究表明蛋白質(zhì)受到低劑量到中劑量(＜10kGy)的輻照后可以觀察到一些功能的改變。黃小波等［8］研究發(fā)現(xiàn)輻照殺菌對(duì)雞蛋蛋白液的pH、起泡性和泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。然而，在這些研究中，目前尚未有人研究低劑量輻照處理紅豆蛋白，并解釋對(duì)其功能特性的影響。

本實(shí)驗(yàn)主要利用60Coγ射線研究不同輻照劑量對(duì)紅豆分離蛋白功能性的影響，包括吸水性、吸油性、溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性，為輻照技術(shù)對(duì)紅豆蛋白改性應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆 購(gòu)于哈爾濱市大潤(rùn)發(fā)超市(產(chǎn)地:黑龍江省海林);九三大豆油 購(gòu)于哈爾濱市大潤(rùn)發(fā)超市;Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司;氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷、鹽酸等試劑 國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 中國(guó)上海雷磁公司;錘片式粉碎機(jī) 中國(guó)天津泰斯特儀器有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司;電子分析天平(0.0001g) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;FJ300-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海越磁電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅豆分離蛋白提取 紅豆脫皮，粉碎過60目篩，正己烷脫脂三次，風(fēng)干后堿溶酸沉法提取，冷凍干燥，得到的紅豆分離蛋白在-20℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅豆蛋白輻照處理 采用透明聚乙烯(PE)塑料袋包裝，50g/袋，輻照處理在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所進(jìn)行輻照裝置為60Coγ輻射源，輻照劑量分別為 1、3、5、7、10kGy。輻照后樣品室溫下貯存。

1.2.3 吸水性(WAC)測(cè)定 將0.2g蛋白樣品與6mL蒸餾水加入離心管，振蕩1min后靜置10min，然后1600r/min離心25min，將上層清液倒出，把剩余樣品連同離心管放于50℃烘箱內(nèi)干燥25min，除去澄清水。吸水性(WHC)以每克蛋白結(jié)合水的克數(shù)表示［9］。

式中:m2為離心管重+沉淀物質(zhì)量(g);m1為離心管重+蛋白質(zhì)量;m為紅豆蛋白樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 吸油性(OAC)測(cè)定 將0.5g樣品與5mL豆油加入10mL離心管中，每5min振蕩30s，30min之后將離心管放入離心機(jī)內(nèi)以1600r/min速度離心25min，讀取剩余大豆油的體積［9］。

式中:V1為加入大豆油總體積(mL);V2為剩余大豆油體積(mL);m為大豆分離蛋白樣品質(zhì)量。

1.2.5 溶解性測(cè)定 稱取100mg紅豆蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌 30min，20℃、12000r/min離心20min。上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比［10］。

1.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定 將15mL蛋白濃度為1%(w/v)的蛋白溶液與5mL大豆油混合，在13500r/min高速均質(zhì)機(jī)下乳化2min，，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，立即開始取樣，取20μL的乳狀液與5mL，0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液均勻混合，在500nm處測(cè)定其吸光值，記為A0，乳狀液靜置30min后采用相同的方法測(cè)定乳狀液吸光值，記為 A30，用 0.1%的 SDS 做空白對(duì)照［11］。

乳化性:

乳化穩(wěn)定性:

其中T=2.303，N:稀釋倍數(shù)250，C:乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度(g/mL)，U:乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)(0.25)。

1.2.7 起泡性及起泡穩(wěn)定性測(cè)定 將一定濃度的蛋白溶液100mL置于500mL量筒中，使用高速乳化均質(zhì)機(jī)以17500r/min的速度均質(zhì)40s，連續(xù)3次共計(jì)2min，記錄均質(zhì)后的液面高度，記為 V0，靜置30min后再 次 記 錄 液 面 高 度，記 為 V30［12］。 起 泡 能 力(Foaming Capacity)和泡沫穩(wěn)定性(Foaming Stability)公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理對(duì)紅豆蛋白持水性和持油性的影響

不同輻照處理對(duì)紅豆蛋白持水性和持油性的影響如圖1所示，隨著輻照劑量的升高，紅豆蛋白的吸水性呈先上升后下降的趨勢(shì)，原因可能是由于輻照使得大量疏水基團(tuán)外露及氫鍵和次級(jí)鍵的破壞，蛋白質(zhì)變?yōu)椴灰?guī)則的松散排列方式，從而與水分子結(jié)合的機(jī)率提高，吸水性增加［13］，隨著輻照劑量的繼續(xù)增加，蛋白結(jié)構(gòu)徹底展開，使原本隱藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來，導(dǎo)致可用于約束水的極性氨基減少，吸水性降低［14］。而吸油性隨著輻照劑量的增加呈上升趨勢(shì)，這可能是由于輻照使得蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵發(fā)生斷裂，形成巰基，使疏水性基團(tuán)暴露，從而吸油性有所增加［13］。而且隨著輻照劑量的增加，蛋白分子粒徑變小，這有助于顆粒與油的接觸面積增加，其分散性增強(qiáng)，因而吸油性有明顯提高。

圖1 不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的吸水性和吸油性的影響Fig.1 Effect of irradiation on water binding capacity and oil binding capacity of red bean protein

2.2 輻照處理對(duì)紅豆蛋白溶解性的影響

在紅豆分離蛋白制備過程中，蛋白分子間通過疏水相互作用等次級(jí)作用力而聚集，在堿分散過程中，部分聚集物不能有效解離，因而影響了蛋白溶解性［15］。在輻照處理時(shí)，紅豆分離蛋白的分子結(jié)構(gòu)展開，蛋白分子解聚，促進(jìn)了溶解性的增強(qiáng)［3］。圖2為對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆蛋白的溶解度變化，由圖可以看出，通過輻照處理后，其溶解性得到了明顯改善，當(dāng)輻照劑量達(dá)到5kGy時(shí)，溶解度達(dá)到最高。但隨著輻照劑量的進(jìn)一步增加，其溶解度有下降趨勢(shì)。原因可能是由于輻照處理破壞了紅豆蛋白中維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵，使肽鏈變得疏松裂解［16］，同水分子結(jié)合能力增強(qiáng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的原有結(jié)構(gòu)破壞，從而使紅豆分離蛋白溶解性的提高。但是隨著輻照劑量的繼續(xù)增加，蛋白分子進(jìn)一步展開，使埋藏分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和巰基進(jìn)一步暴露，伸展的蛋白分子之間通過非共價(jià)鍵作用重新形成大分子聚集體，因此溶解度下降［17］。

圖2 不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的溶解度的影響Fig.2 Effect of irradiation on solubility of red bean protein

2.3 輻照處理對(duì)紅豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的乳化特性與蛋白質(zhì)溶解度、表面疏水性以及表面電荷分布相關(guān)［3］。還與分子的柔順性及疏水性有關(guān)［18］，圖3為不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性指數(shù)的影響，如圖所示，隨著輻照處理劑量的增加，紅豆分離蛋白的乳化性得到顯著提高，當(dāng)輻照劑量達(dá)到5kGy時(shí)，乳化性達(dá)到最高，這是因?yàn)檩椪仗幚硎沟鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露，疏水基團(tuán)數(shù)量的增加會(huì)使蛋白更傾向于吸附在空氣/水或油/水界面，造成乳化能力的升高［19］。但輻照劑量達(dá)到10kGy時(shí)，反而有顯著下降，這可能是紅豆蛋白分子內(nèi)部發(fā)生聚集，聚集體具有一個(gè)疏水核心，外層被親水基團(tuán)包圍，達(dá)到了界面張力大幅降低的臨界點(diǎn)，隨著輻射劑量的加強(qiáng)，超過了臨界點(diǎn)，乳化性下降［13，20］。低劑量的輻照處理對(duì)乳化穩(wěn)定性沒有顯著性影響，當(dāng)劑量升高到5kGy時(shí)，乳化穩(wěn)定性得到提高，可能是輻照加強(qiáng)了對(duì)油的吸附能力，而核外的親水基團(tuán)又加強(qiáng)了對(duì)水的結(jié)合能力［13］。

圖3 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.3 Effect of irradiation on emulsifying capacity and emulsifying stability of red bean protein

2.4 輻照處理對(duì)紅豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性如圖4所示，由圖可見，輻照處理可一定程度上提高蛋白溶液的起泡性和起泡穩(wěn)定性，造成起泡特性變化的主要原因是輻照過程中蛋白質(zhì)分子聚集體的形成與解離，導(dǎo)致分子的機(jī)械強(qiáng)度以及分子柔韌性的變化而引起的［11］。隨著輻照劑量的增加，起泡性呈先上升后下降趨勢(shì)，這可能是由于輻照處理使疏水基團(tuán)充分暴露，紅豆蛋白具有更大的表面活性，能降低水的表面張力，在劇烈攪拌時(shí)形成豐富的泡沫［21］，但隨著輻照劑量的增加，可溶性聚集體通過聚集形成更大的聚集體或者是可溶性聚集體解離，分解為分子量過小的肽鏈，不利于分子柔韌性以及機(jī)械強(qiáng)度的改善，造成了起泡性的下降［11］。隨著輻照劑量的增加，泡沫穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)，泡沫穩(wěn)定性的提高說明蛋白分子的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性沒有遭到破壞，另一方面，二硫鍵對(duì)泡沫穩(wěn)定性起著相當(dāng)重要的作用［22］，輻照處理后疏水性增強(qiáng)，更多的疏水部位和-SH的暴露，促進(jìn)了疏水相互作用和-SH向-S-S-的交換反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間相互作用的增強(qiáng)，泡沫穩(wěn)定性提高［23］。

圖4 對(duì)照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性Fig.4 Effect of irradiation on foaming capacity and foaming stability of red bean protein

3 結(jié)論

輻照處理對(duì)紅豆蛋白功能性質(zhì)有顯著影響。隨著輻照劑量的增加，紅豆蛋白的吸水性、溶解性、乳化性、起泡性均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而吸油性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性則呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，這與不同劑量的輻照處理對(duì)紅豆蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)。在低劑量輻照處理時(shí)，紅豆蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)變?yōu)椴灰?guī)則的松散排列方式，同混合相中其他物質(zhì)結(jié)合能力增強(qiáng)，使紅豆蛋白的功能性質(zhì)得以提升，但隨著輻照劑量的增加，埋藏在內(nèi)部的疏水基團(tuán)和巰基暴露，蛋白分子之間通過非共價(jià)鍵作用形成聚集體，紅豆蛋白分子發(fā)生聚集，使吸水性、溶解性、乳化性等功能性質(zhì)下降，但不斷增大的疏水作用使蛋白分子間作用不斷增強(qiáng)，吸油性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性繼續(xù)增強(qiáng)。不同劑量的輻照處理使紅豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)。

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