伽馬射線輻照對紅豆分離蛋白功能性質的影響

李 楊，王 晶，陳 勇，馬文君，王中江，王 瑞，畢 爽，江連洲，2，*

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

紅豆(Phaseolus angularis)菜豆屬，豆科，俗稱“赤小豆”、“紅豆”、“赤豆”、“紅小豆”、“小豆”［1］。紅豆中蛋白質含量平均為25.2%，是一種優質的植物蛋白來源，營養分析顯示紅豆的氨基酸種類齊全，必需氨基酸水平達到甚至高于FAO/WHO的要求［2］。紅豆蛋白作為豆類蛋白，它具有和大豆分離蛋白許多相似的蛋白結構和功能特性，如溶解性，乳化性，起泡性等。但紅豆蛋白在我國利用率相對較低，是一種潛在的質優豆類蛋白資源［3］。隨著人們生活水平的提高和健康意識的加強，對紅豆蛋白資源開發和綜合利用研究已逐步發展起來，這對于改善人們的膳食結構具有重要意義［4］。

輻照技術，是借助鈷-60所產生的高能量、強穿透性的伽馬射線，電離和激發物質產生的活化分子與活化原子，并發生一系列物理、化學、與生物化學變化，使物質發生聚合、交聯、降解、并發生改性［5］。在食品方面，國際輻照食品聯合專家委員會(JECFI)，審閱并核實了大量國際研究資料后，在1980年得出“以貯存為目的，任何食品受到10kGy以下的輻照，沒有毒理學危險，在營養學和微生物學上也是安全的”的結論［6］。近年來，我國逐步加快了輻照技術在食品中的應用研究，羅春萍［7］通過研究表明蛋白質受到低劑量到中劑量(＜10kGy)的輻照后可以觀察到一些功能的改變。黃小波等［8］研究發現輻照殺菌對雞蛋蛋白液的pH、起泡性和泡沫穩定性、乳化性和乳化穩定性都會產生一定的影響。然而，在這些研究中，目前尚未有人研究低劑量輻照處理紅豆蛋白，并解釋對其功能特性的影響。

本實驗主要利用60Coγ射線研究不同輻照劑量對紅豆分離蛋白功能性的影響，包括吸水性、吸油性、溶解性、乳化性、乳化穩定性、起泡性和起泡穩定性，為輻照技術對紅豆蛋白改性應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆 購于哈爾濱市大潤發超市(產地:黑龍江省海林);九三大豆油 購于哈爾濱市大潤發超市;Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司;氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷、鹽酸等試劑 國產分析純試劑。

PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司;錘片式粉碎機 中國天津泰斯特儀器有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司;電子分析天平(0.0001g) 北京賽多利斯儀器系統有限公司;高速離心機 德國Eppendorf公司;FJ300-S數顯高速分散均質機 上海越磁電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅豆分離蛋白提取 紅豆脫皮，粉碎過60目篩，正己烷脫脂三次，風干后堿溶酸沉法提取，冷凍干燥，得到的紅豆分離蛋白在-20℃下儲存備用。

1.2.2 紅豆蛋白輻照處理 采用透明聚乙烯(PE)塑料袋包裝，50g/袋，輻照處理在黑龍江省農業科學院玉米研究所進行輻照裝置為60Coγ輻射源，輻照劑量分別為 1、3、5、7、10kGy。輻照后樣品室溫下貯存。

1.2.3 吸水性(WAC)測定 將0.2g蛋白樣品與6mL蒸餾水加入離心管，振蕩1min后靜置10min，然后1600r/min離心25min，將上層清液倒出，把剩余樣品連同離心管放于50℃烘箱內干燥25min，除去澄清水。吸水性(WHC)以每克蛋白結合水的克數表示［9］。

式中:m2為離心管重+沉淀物質量(g);m1為離心管重+蛋白質量;m為紅豆蛋白樣品質量(g)。

1.2.4 吸油性(OAC)測定 將0.5g樣品與5mL豆油加入10mL離心管中，每5min振蕩30s，30min之后將離心管放入離心機內以1600r/min速度離心25min，讀取剩余大豆油的體積［9］。

式中:V1為加入大豆油總體積(mL);V2為剩余大豆油體積(mL);m為大豆分離蛋白樣品質量。

1.2.5 溶解性測定 稱取100mg紅豆蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌 30min，20℃、12000r/min離心20min。上清液經適度稀釋，采用Lowry法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白質量濃度占總蛋白質量濃度的百分比［10］。

1.2.6 乳化性及乳化穩定性測定 將15mL蛋白濃度為1%(w/v)的蛋白溶液與5mL大豆油混合，在13500r/min高速均質機下乳化2min，，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，立即開始取樣，取20μL的乳狀液與5mL，0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液均勻混合，在500nm處測定其吸光值，記為A0，乳狀液靜置30min后采用相同的方法測定乳狀液吸光值，記為 A30，用 0.1%的 SDS 做空白對照［11］。

乳化性:

乳化穩定性:

其中T=2.303，N:稀釋倍數250，C:乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度(g/mL)，U:乳化液中油的體積分數(0.25)。

1.2.7 起泡性及起泡穩定性測定 將一定濃度的蛋白溶液100mL置于500mL量筒中，使用高速乳化均質機以17500r/min的速度均質40s，連續3次共計2min，記錄均質后的液面高度，記為 V0，靜置30min后再 次 記 錄 液 面 高 度，記 為 V30［12］。 起 泡 能 力(Foaming Capacity)和泡沫穩定性(Foaming Stability)公式如下:

2 結果與分析

2.1 輻照處理對紅豆蛋白持水性和持油性的影響

不同輻照處理對紅豆蛋白持水性和持油性的影響如圖1所示，隨著輻照劑量的升高，紅豆蛋白的吸水性呈先上升后下降的趨勢，原因可能是由于輻照使得大量疏水基團外露及氫鍵和次級鍵的破壞，蛋白質變為不規則的松散排列方式，從而與水分子結合的機率提高，吸水性增加［13］，隨著輻照劑量的繼續增加，蛋白結構徹底展開，使原本隱藏在蛋白質分子內部的疏水性基團暴露出來，導致可用于約束水的極性氨基減少，吸水性降低［14］。而吸油性隨著輻照劑量的增加呈上升趨勢，這可能是由于輻照使得蛋白質分子間的二硫鍵發生斷裂，形成巰基，使疏水性基團暴露，從而吸油性有所增加［13］。而且隨著輻照劑量的增加，蛋白分子粒徑變小，這有助于顆粒與油的接觸面積增加，其分散性增強，因而吸油性有明顯提高。

圖1 不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的吸水性和吸油性的影響Fig.1 Effect of irradiation on water binding capacity and oil binding capacity of red bean protein

2.2 輻照處理對紅豆蛋白溶解性的影響

在紅豆分離蛋白制備過程中，蛋白分子間通過疏水相互作用等次級作用力而聚集，在堿分散過程中，部分聚集物不能有效解離，因而影響了蛋白溶解性［15］。在輻照處理時，紅豆分離蛋白的分子結構展開，蛋白分子解聚，促進了溶解性的增強［3］。圖2為對照樣品和不同劑量輻照處理紅豆蛋白的溶解度變化，由圖可以看出，通過輻照處理后，其溶解性得到了明顯改善，當輻照劑量達到5kGy時，溶解度達到最高。但隨著輻照劑量的進一步增加，其溶解度有下降趨勢。原因可能是由于輻照處理破壞了紅豆蛋白中維持蛋白質高級結構的次級鍵，使肽鏈變得疏松裂解［16］，同水分子結合能力增強導致蛋白質分子的原有結構破壞，從而使紅豆分離蛋白溶解性的提高。但是隨著輻照劑量的繼續增加，蛋白分子進一步展開，使埋藏分子內部的疏水基團和巰基進一步暴露，伸展的蛋白分子之間通過非共價鍵作用重新形成大分子聚集體，因此溶解度下降［17］。

圖2 不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的溶解度的影響Fig.2 Effect of irradiation on solubility of red bean protein

2.3 輻照處理對紅豆蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

蛋白質的乳化特性與蛋白質溶解度、表面疏水性以及表面電荷分布相關［3］。還與分子的柔順性及疏水性有關［18］，圖3為不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的乳化性和乳化穩定性指數的影響，如圖所示，隨著輻照處理劑量的增加，紅豆分離蛋白的乳化性得到顯著提高，當輻照劑量達到5kGy時，乳化性達到最高，這是因為輻照處理使蛋白質結構展開，疏水基團暴露，疏水基團數量的增加會使蛋白更傾向于吸附在空氣/水或油/水界面，造成乳化能力的升高［19］。但輻照劑量達到10kGy時，反而有顯著下降，這可能是紅豆蛋白分子內部發生聚集，聚集體具有一個疏水核心，外層被親水基團包圍，達到了界面張力大幅降低的臨界點，隨著輻射劑量的加強，超過了臨界點，乳化性下降［13，20］。低劑量的輻照處理對乳化穩定性沒有顯著性影響，當劑量升高到5kGy時，乳化穩定性得到提高，可能是輻照加強了對油的吸附能力，而核外的親水基團又加強了對水的結合能力［13］。

圖3 對照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的乳化性和乳化穩定性Fig.3 Effect of irradiation on emulsifying capacity and emulsifying stability of red bean protein

2.4 輻照處理對紅豆蛋白起泡性及起泡穩定性的影響

不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的起泡性及起泡穩定性如圖4所示，由圖可見，輻照處理可一定程度上提高蛋白溶液的起泡性和起泡穩定性，造成起泡特性變化的主要原因是輻照過程中蛋白質分子聚集體的形成與解離，導致分子的機械強度以及分子柔韌性的變化而引起的［11］。隨著輻照劑量的增加，起泡性呈先上升后下降趨勢，這可能是由于輻照處理使疏水基團充分暴露，紅豆蛋白具有更大的表面活性，能降低水的表面張力，在劇烈攪拌時形成豐富的泡沫［21］，但隨著輻照劑量的增加，可溶性聚集體通過聚集形成更大的聚集體或者是可溶性聚集體解離，分解為分子量過小的肽鏈，不利于分子柔韌性以及機械強度的改善，造成了起泡性的下降［11］。隨著輻照劑量的增加，泡沫穩定性呈上升趨勢，泡沫穩定性的提高說明蛋白分子的機械強度和柔韌性沒有遭到破壞，另一方面，二硫鍵對泡沫穩定性起著相當重要的作用［22］，輻照處理后疏水性增強，更多的疏水部位和-SH的暴露，促進了疏水相互作用和-SH向-S-S-的交換反應，導致蛋白質分子間相互作用的增強，泡沫穩定性提高［23］。

圖4 對照樣品和不同劑量輻照處理紅豆分離蛋白的起泡性及起泡穩定性Fig.4 Effect of irradiation on foaming capacity and foaming stability of red bean protein

3 結論

輻照處理對紅豆蛋白功能性質有顯著影響。隨著輻照劑量的增加，紅豆蛋白的吸水性、溶解性、乳化性、起泡性均呈現先增加后減少的趨勢，而吸油性、乳化穩定性和泡沫穩定性則呈現持續上升的趨勢，這與不同劑量的輻照處理對紅豆蛋白分子結構的影響有關。在低劑量輻照處理時，紅豆蛋白的蛋白質結構展開，蛋白質變為不規則的松散排列方式，同混合相中其他物質結合能力增強，使紅豆蛋白的功能性質得以提升，但隨著輻照劑量的增加，埋藏在內部的疏水基團和巰基暴露，蛋白分子之間通過非共價鍵作用形成聚集體，紅豆蛋白分子發生聚集，使吸水性、溶解性、乳化性等功能性質下降，但不斷增大的疏水作用使蛋白分子間作用不斷增強，吸油性、乳化穩定性和泡沫穩定性繼續增強。不同劑量的輻照處理使紅豆蛋白質結構發生不同程度的改變，進而影響其功能性質。

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