DHEA衍生物的穩定性研究

黃阿三　林森　楊建云等

[摘 要] 目的：通過破壞試驗（強酸、強堿、氧化）考察建立高效液相色譜法的專屬性；研究影響因素試驗（高溫、高濕、光照）中DHEA衍生物的外觀性狀、有關物質及含量的變化，初步考察其穩定性。方法：利用高效液相色譜法，通過與對照品比較，觀察變化情況。結果：在高溫和光照條件下，DHEA衍生物都比較穩定；在高濕條件下，雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會有所降低，只有99.4%。結論：DHEA衍生物在所有考察條件中均很穩定，但會引濕增重，故保存過程中應注意防潮。

[關鍵詞] DHEA衍生物；高效液相色譜法；破壞試驗；影響因素試驗；穩定性

中圖分類號： o623.7 文獻標識碼： A 文章編號：2095-5200（2014）06-062-03

DHEA衍生物（derivative of DHEA，化學名為5β-雄甾烷-3α，17β-二醇）是一種具有合成作用的睪酮前體類固醇藥物，為天然的腎上腺皮質激素類，具有抗糖皮質激素活性的作用。人體肝臟里有一種3β-羥基類固醇脫氫酶可以把它轉化為睪酮，因此它是一步轉化，不經中間體代謝。且有實驗證明DHEA衍生物的免疫調節作用，具有顯著增加循環嗜中性粒細胞、血小板和NK細胞的功能[1-4]。由于DHEA衍生物與人體的生理活動密切相關，因此，需增加對DHEA衍生物的了解，以便更好地發揮DHEA衍生物的生理學作用、減小或消除DHEA衍生物的生理學危害。

本課題組建立了DHEA衍生物的RP-HPLC的檢測方法，成功地將其與有關物質進行了分離，建立了工作曲線，檢測限低至33ng。但是，對于DHEA衍生物穩定性的研究卻未見報道[5]，而DHEA衍生物的穩定性對高效發揮其藥用作用有重要指導意義。因此，本文主要開展關于討論DHEA穩定性的實驗。

本文預期通過酸、堿、氧化破壞試驗引起DHEA衍生物的降解，應用所建立的RP-HPLC方法檢測降解后的物質，得到破壞試驗后DHEA衍生物的含量信息，從而獲知酸、堿、氧化破壞試驗對DHEA衍生物穩定性的影響，為藥物可能的降解途徑和降解機制提供實驗依據。為進一步探討DHEA衍生物的固有穩定性，并了解影響其穩定性因素，進行了DHEA衍生物的影響因素（溫度、濕度、光線）試驗，通過HPLC法分析其含量、性狀和有關物質隨時間的變化，為制劑生產工藝、包裝、貯存條件和建立降解產物分析方法提供依據。本法方便、快速、靈敏度高、專屬性強、精密，結果準確可靠。

1 實驗部分

1.1 儀器和藥品

Waters 600-717-996 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，自動進樣器，美國）；電子分析天平（Sartorius，BP211D）；恒溫水浴鍋（B-260，上海亞榮生化儀器廠）；真空超聲波清洗儀（KQ-6030，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈（色譜純，禹王試劑）；水（娃哈哈純凈水）；鹽酸（AR，北京化學試劑公司）；氫氧化鈉（AR，汕頭西隴化工有限公司）；30%雙氧水（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；硝酸鉀（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；DHEA衍生物均由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供批號（20120514）。

1.2 色譜條件

1.3 試驗方法

1.3.1 破壞試驗 取DHEA衍生物約30mg，置25mL量瓶中，進行如下酸、堿、氧化破壞試驗。

1.3.1.1 酸破壞 滴加1 mol/L的鹽酸溶液 10mL，于90℃水浴中加熱8h，再加1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調節pH至中性，過濾，將固體晾干后，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項下的色譜條件進樣分析。

1.3.1.2 堿破壞 滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液10mL，于90℃水浴中加熱8h，再加1 mol/L的鹽酸溶液，調節pH至中性，過濾，將固體晾干后，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項下的色譜條件進樣分析。

1.3.1.3 氧化破壞 滴加30%的過氧化氫溶液10mL，放置三天后于90℃水浴中加熱8h，過濾，將固體晾干后，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項下的色譜條件進樣分析。

在酸、堿、氧化破壞實驗中，由于DHEA衍生物幾乎不溶于水，所以破壞后過濾取其濾渣加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項下的色譜條件進樣分析。

1.3.2 影響因素試驗 穩定性研究的考察項目應選擇在藥品保存期間易于變化，并可能會影響到藥品的質量、安全性和有效性的項目，以便客觀、全面地反映藥品的穩定性。以下為影響因素穩定性研究的一般要求。

1.3.2.1 高溫試驗 取DHEA衍生物開口置適宜的潔凈容器中，60℃溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.2”項下的色譜條件進行檢測，并與0時間的比較。

1.3.2.2 高濕試驗 取DHEA衍生物開口置恒濕密閉容器中，在25℃分別于相對濕度90%±5%（下部放置KNO3飽和溶液）條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.2”項下的色譜條件進行檢測，并與0時間的比較，結果見表2。

1.3.2.3 光照試驗 取DHEA衍生物開口放在裝有日光燈的光照箱內，在照度為4500lx±500lx的條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.2”項下的色譜條件進行檢測，并與0時間的比較。

2 結果

分別選用1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液進行破壞性試驗。由表1可知，樣品經過酸、堿及氧化破壞后主峰面積均在99.5%以上，也沒有雜質降解，結果與對照品（99.53%）一樣，在實驗過程中，為了能夠提高降解強度，我們從0.1 mol/L濃度一直提高到1mol/L，并且溫度也從一般的室溫20℃一直嘗試加熱到90℃，考察的時間也延長到8h，大大增加了降解條件強度，但試驗結果均沒有產生新的降解產物。試驗中，主峰的峰面積和保留時間基本上保持不變，由此也可以說明DHEA衍生物沒有被降解，主峰與有關物質的分離度也比較好，所以在這些條件下DHEA衍生物相對穩定。endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高溫、光照條件下外觀性狀均為白色粉末，沒有變化，含量也相對穩定。在中國藥典中，原料藥的穩定性試驗中高溫試驗的溫度一般不超過60℃，但我們也曾試將溫度升高（至105℃）以達到降解破壞的目的，但主峰的含量及保留時間基本上還是保持不變，所以在高溫、光照試驗中都可以說明DHEA衍生物比較穩。在高濕條件下雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會有所降低，只有99.4%，這是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生產、貯存、運輸中應注意密封并保持干燥。有關物質Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積百分比也基本不變，而且它們能夠很好的和主峰分開，分離度都大于1.5。由此也再一次證明所建立的方法專屬性強。對于表2中峰面積百分比大于0.1的有關物質Ⅲ通過HPLC、UV、GC-MS進行了結構分析，發現它為反應原料之一DHEA，并非為新降解的產物，故在影響因素考察試驗中DHEA衍生物穩定性很好。

3 結論

本文通過HPLC法分析DHEA衍生物在溫度、濕度、光照環境中的穩定性進行了全面的研究，并提供了具體的實驗數據。

經1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液的破壞性試驗后，主峰的保留時間沒有發生改變，未破壞出降解產物。且主峰的分離度均大于1.5。

在高溫、光照條件下放置10d，各項指標無明顯變化，對熱穩定，對光照穩定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高濕（RH 90%±5%）環境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料樣和相關制劑的生產、運輸和貯存過程中應盡可能的避免高濕。

目前無法在破壞試驗中得到降解產物，說明DHEA衍生物在這些條件下穩定，可以為以后的相關制劑提供了參考。

本法方便、快速、靈敏度高，結果準確可靠，專屬性強。

參 考 文 獻

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[M].2010年版，北京，2010：二部，附錄.endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高溫、光照條件下外觀性狀均為白色粉末，沒有變化，含量也相對穩定。在中國藥典中，原料藥的穩定性試驗中高溫試驗的溫度一般不超過60℃，但我們也曾試將溫度升高（至105℃）以達到降解破壞的目的，但主峰的含量及保留時間基本上還是保持不變，所以在高溫、光照試驗中都可以說明DHEA衍生物比較穩。在高濕條件下雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會有所降低，只有99.4%，這是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生產、貯存、運輸中應注意密封并保持干燥。有關物質Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積百分比也基本不變，而且它們能夠很好的和主峰分開，分離度都大于1.5。由此也再一次證明所建立的方法專屬性強。對于表2中峰面積百分比大于0.1的有關物質Ⅲ通過HPLC、UV、GC-MS進行了結構分析，發現它為反應原料之一DHEA，并非為新降解的產物，故在影響因素考察試驗中DHEA衍生物穩定性很好。

3 結論

本文通過HPLC法分析DHEA衍生物在溫度、濕度、光照環境中的穩定性進行了全面的研究，并提供了具體的實驗數據。

經1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液的破壞性試驗后，主峰的保留時間沒有發生改變，未破壞出降解產物。且主峰的分離度均大于1.5。

在高溫、光照條件下放置10d，各項指標無明顯變化，對熱穩定，對光照穩定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高濕（RH 90%±5%）環境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料樣和相關制劑的生產、運輸和貯存過程中應盡可能的避免高濕。

目前無法在破壞試驗中得到降解產物，說明DHEA衍生物在這些條件下穩定，可以為以后的相關制劑提供了參考。

本法方便、快速、靈敏度高，結果準確可靠，專屬性強。

參 考 文 獻

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[M].2010年版，北京，2010：二部，附錄.endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高溫、光照條件下外觀性狀均為白色粉末，沒有變化，含量也相對穩定。在中國藥典中，原料藥的穩定性試驗中高溫試驗的溫度一般不超過60℃，但我們也曾試將溫度升高（至105℃）以達到降解破壞的目的，但主峰的含量及保留時間基本上還是保持不變，所以在高溫、光照試驗中都可以說明DHEA衍生物比較穩。在高濕條件下雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會有所降低，只有99.4%，這是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生產、貯存、運輸中應注意密封并保持干燥。有關物質Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積百分比也基本不變，而且它們能夠很好的和主峰分開，分離度都大于1.5。由此也再一次證明所建立的方法專屬性強。對于表2中峰面積百分比大于0.1的有關物質Ⅲ通過HPLC、UV、GC-MS進行了結構分析，發現它為反應原料之一DHEA，并非為新降解的產物，故在影響因素考察試驗中DHEA衍生物穩定性很好。

3 結論

本文通過HPLC法分析DHEA衍生物在溫度、濕度、光照環境中的穩定性進行了全面的研究，并提供了具體的實驗數據。

經1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液的破壞性試驗后，主峰的保留時間沒有發生改變，未破壞出降解產物。且主峰的分離度均大于1.5。

在高溫、光照條件下放置10d，各項指標無明顯變化，對熱穩定，對光照穩定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高濕（RH 90%±5%）環境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料樣和相關制劑的生產、運輸和貯存過程中應盡可能的避免高濕。

目前無法在破壞試驗中得到降解產物，說明DHEA衍生物在這些條件下穩定，可以為以后的相關制劑提供了參考。

本法方便、快速、靈敏度高，結果準確可靠，專屬性強。

參 考 文 獻

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[M].2010年版，北京，2010：二部，附錄.endprint