注射用丹參多酚酸鹽無菌檢查方法學驗證

徐全華，單天炎，李忠輝，張 瑩，吳蒙恩

(杭州澳亞生物技術有限公司，浙江杭州 310018)

注射用丹參多酚酸鹽具有活血、化瘀、通脈功效，用于冠心病穩定型心絞痛，中醫辨證為心血瘀阻證者，癥見胸痛、胸悶、心悸［1］。根據《中國藥典》2010年版一部無菌檢查法的規定，建立藥品無菌檢查方法時，應該進行方法學驗證，以證明方法的適用性［2］。目前，還未見注射用丹參多酚酸鹽無菌檢查方法學驗證的相關資料，為確保該產品檢查方法科學、結果準確，本文按中國藥品檢驗標準操作規范建立了注射用丹參多酚酸鹽無菌檢查方法，并對方法進行了驗證［3］。

1 儀器與材料

XG1.DWXD－0.36型脈動真空滅菌器(山東新華醫療器械廠);HTY－Ⅲ型智能集菌儀(杭州泰林生物技術設備有限公司);KDGB220、KDGB330型一次性全封閉集菌培養器(杭州泰林生物技術設備有限公司);LRH－250－Ⅱ型、LRH－250型生化培養箱(廣東省醫療器械廠)。

注射用丹參多酚酸鹽(規格:100mg，杭州澳亞生物技術有限公司生產，批號:12102325、12102425、12110725)。

試驗用菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］;銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］;生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64 941］;大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44 102］;白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98 001］;黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］。上述菌種由浙江省食品藥品檢驗所提供。

驗證用培養基:硫乙醇酸鹽流體培養基;改良馬丁培養基;營養肉湯培養基;營養瓊脂培養基;玫瑰紅鈉瓊脂培養基;改良馬丁瓊脂培養基。上述培養基由杭州微生物試劑有限公司提供。

稀釋液和沖洗液:0.1%蛋白胨水溶液(杭州澳亞生物技術有限公司質檢部配制)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養物，用白金耳接種至營養肉湯培養基中，取生孢梭菌的新鮮培養物，用白金耳接種至硫乙醇酸鹽流體培養基中，32.5℃培養24 h。取白色念珠菌的新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，25.5℃培養24 h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 cfu的菌懸液。

取黑曲霉斜面的新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，25.5℃培養5 d，使大量孢子成熟，加5 mL含0.05%(mL·mL－1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，用白金耳輕輕將孢子洗脫，用管口帶紗布的無菌毛細吸管吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%(mL·mL－1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉注射液制成每1 mL含孢子數小于100 cfu的孢子懸液。

2.2 菌液計數 分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各1mL于培養皿中，每種菌做兩個平皿，加營養瓊脂培養基;取白色念珠菌、黑曲霉菌各1 mL于培養皿中，每種菌做兩個平皿，加玫瑰紅鈉瓊脂培養基，按規定條件培養，結果見表1。由表1可知，各菌種在相應的稀釋度下，每毫升菌落計數結果符合規定。

表1 微生物計數結果

2.3 培養基的無菌性試驗 取硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各8支，在相應的培養條件下培養14 d，結果見表2(注:“+”代表有菌生長，“—”代表無菌生長，以下表格符號意義相同)。由表2可知，二種培養基的無菌性符合規定。

2.4 培養基的靈敏度試驗 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另一支不接種作為空白對照，按相應的條件培養3 d。每管裝量為9 mL的改良馬丁培養基5支，分別接種小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種作為空白對照，按相應的條件培養5 d。每天觀察記錄，結果見表3。由表3可知，培養基的靈敏度試驗結果符合規定。

2.5 薄膜過濾法方法學驗證［4－8］每批取供試品180支，每支用0.1%蛋白胨緩沖液5 mL溶解，每10支為一組，分成18組，每組使用一個過濾器，其中6組未用沖洗液沖洗，另6組沖洗量為100 mL，再6組沖洗量為300 mL，在最后一次沖洗液中加入每1 mL小于100 cfu的試驗菌1 mL，過濾后，將相應的培養基100 mL加至各濾筒內作為供試品陽性對照(PPC)。另取集菌培養器，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照(PC)。按規定溫度培養3～5 d，各試驗菌同法操作，結果見表4、表5、表6。由表4～表6可知，三批產品在設定沖洗量為未沖洗、100 mL和300 mL條件下，對6種菌株而言供試品陽性對照和陽性對照均生長良好，并且無明顯差異，均無抑菌作用，因此，確定該產品無菌檢查方法為:取本品，用0.1%蛋白胨水溶液溶解，采用薄膜過濾法過濾，無需經沖洗液沖洗，直接加相應的培養基培養。

2.6 樣品的無菌檢查 每批取供試品30支，每支用0.1%蛋白胨水溶液5 mL溶解，取三聯管全封閉集菌培養器直接過濾，其中一管加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基，另一管加入100 mL改良馬丁培養基，第三管加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基并接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液作供試品陽性對照，另取稀釋液，同法操作，作為陰性對照，按規定溫度培養14 d，結果見表7。由表7可知，三批產品按驗證確定的方法進行檢查，供試品陽性對照和陰性對照均成立，產品符合無菌要求。

表2 培養基的無菌性檢查結果

表3 培養基的靈敏度試驗結果

表4 注射用丹參多酚酸鹽方法學驗證結果(批號:12102325)

表5 注射用丹參多酚酸鹽方法學驗證結果(批號:12102425)

表6 注射用丹參多酚酸鹽方法學驗證結果(批號:12110725)

表7 樣品無菌檢查試驗結果

3 討論

根據《中國藥典》二部附錄Ⅺ無菌檢查法的要求，無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法，因此，本品采用薄膜過濾法進行了相應的研究。此外，由于注射用丹參多酚酸鹽為非抗菌藥物，因此，選擇金黃色葡萄球菌作陽性對照菌。研究結果表明:注射用丹參多酚酸鹽在試驗菌液計數及所用培養基無菌性、靈敏度符合規定條件下，三批產品未經沖洗、以及沖洗量為100 mL和300 mL三組之間供試品陽性對照組生長情況與陽性對照組生長情況一致，表明該產品無抑菌和干擾作用。三批樣品經檢查，符合無菌要求。因此，確定該產品無菌檢查方法為:取本品30支，每支用0.1%蛋白胨水溶液5 mL溶解，用薄膜過濾法處理后，依法檢查，應符合規定。通過上述驗證所建立的方法可用于注射用丹參多酚酸鹽的無菌檢查，結果準確、可靠。

［1］ 宋燕青，徐向陽，孫仁弟.注射用丹參多酚酸鹽的臨床應用概述［J］.藥物流行病學雜志，2012，21(8):404 －406.

［2］ 國家藥典委員會.中國藥典:一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄76 －79.

［3］ 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:337－351.

［4］ 陳曉寧.注射用七葉皂苷鈉無菌檢查方法學驗證［J］.中國醫藥導報，2011，8(1):48 －49.

［5］ 許 威，李 翔.氟羅沙星注射液無菌檢查方法的探討［J］.安徽醫藥，2011，15(10):1228 －1229.

［6］ 江志杰，高 春.三種中藥注射劑無菌檢查方法的建立和結果評價［J］.中國現代藥物應用，2013，7(3):15 －17.

［7］ 閔 紅，裴小龍，楊曉莉.三種規格注射用頭孢地嗪鈉無菌方法學驗證［J］.安徽醫藥，2013，17(5):764 －766.

［8］ 吳 煒.羥乙基淀粉(200/0.5)乳酸鈉林格注射液無菌檢查方法學驗證［J］.安徽醫藥，2013，17(8):1300 －1302.