HPLC法同時測定養(yǎng)血安神片中梓醇與毛蕊花糖苷的含量

許 永，趙 成

(1.安徽省六安市中醫(yī)院;2.安徽省六安市食品藥品檢驗所，安徽 六安 237000)

養(yǎng)血安神片的主要由地黃、熟地黃、仙鶴草、雞血藤、墨旱蓮、合歡皮、首烏藤等中藥組成，具有滋陰養(yǎng)血，寧心安神的功效。臨床用于治療陰虛血少、頭眩心悸、失眠健忘。其中地黃具有清熱涼血，養(yǎng)陰，生津的作用;熟地黃更有益精補髓、滋陰養(yǎng)血的功效［1］，是方中的君味，主要含有環(huán)稀醚萜苷類如梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷 A，B，C，D、單蜜力特甙、和雙氫梓醇等成分。養(yǎng)血安神片現(xiàn)用質(zhì)量標準仍按1993年衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第八冊進行檢驗，標準中對可控性強的含量數(shù)據(jù)未作研究，查相關資料也未有報道。文中筆者選擇成分中水溶性核苷成分——毛蕊花糖苷以及梓醇作為定量標準［2－3］，通過采用高效液相色譜法來實現(xiàn)成分含量的測定，以求從多方面控制養(yǎng)血安神片的治療質(zhì)量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 檢測實驗中使用到的儀器為Agilent 1000高效液相色譜儀，其中具體配件包括有在線脫氣機、四元泵、柱溫箱、VWD紫外檢測器、自動進樣器以及色譜工作站。梅特勒電子天平XP6U(精密度:0.0001 mg)。

1.2 實驗試劑 實驗中用到的試劑主要有乙腈色譜純、自制純化水、甲醇色譜純以及色譜用磷酸等。

1.3 實驗藥品 試驗中毛蕊花糖苷對照品購于為中國國家藥品生物制品鑒定所，其批號為110520－201020;梓醇購于為中國國家藥品生物制品鑒定所，其批號為110808－201108。養(yǎng)血安神片為市場隨機購買(山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批號:120712、120806、120921)。

2 方法

2.1 測定色譜條件選擇以及系統(tǒng)適應性實驗 色譜柱為AgilentSB-AQ，其參數(shù)為(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流速控制在 1.0 mL·min－1，檢測波長為210 nm，柱溫保持30℃。流動相0.1%磷酸溶液－乙腈:0 ～14.00 min(1%乙腈)，14.01 ～36.00 min(20%乙腈)。理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷峰不低于3 000，而梓醇峰不低于4 000。

2.2 實驗中試液配制

2.2.1 混合對照品溶液制備 精密稱取梓醇對照品5.10 mg以及毛蕊花糖苷對照品 10.20 mg，用(1%乙腈)流動相定容至50 mL容量瓶中，均勻混合，得到濃度為 102 mg·L－1以及 204 mg·L－1的對照品混合溶液。

2.2.2 供應品溶液制備 取供試品除去包衣，研細，稱量1.0 g，精密稱定，加入甲醇100 mL，回流90 min，待溶液冷卻后進行精密稱重，用甲醇進行補重，過濾，取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干。殘渣利用流動相即1%乙腈溶解轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中并定容，即可得到供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液制備依據(jù)藥品所給處方比例稱取除地黃、熟地黃外的其它藥材同樣質(zhì)量，按養(yǎng)血安神片規(guī)定的制作工藝及供應品的制備方法來實現(xiàn)陰性溶液的制備。

2.3 系統(tǒng)試驗性試驗 分別取出適量混合對照品溶液、供試品溶液以及陰性溶液，用0.45 μm的過濾頭過濾。按照上小節(jié)2.1中所列的色譜條件對三種實驗溶液進行進樣10 μL，得到圖1，理論塔板數(shù)符合要求。

圖1 HPLC圖

2.4 空白實驗 分別取供應品溶液、對照品溶液以及陰性溶液按各10 μL參照上述色譜條件進樣實現(xiàn)毛蕊花糖苷含量的測定，得到的圖譜結(jié)果顯示陰性溶液無干擾(圖1)。

2.5 線性關系的考察 分別取得2.2.1小節(jié)制備條件下的混合對照品溶液 10、8、6、4、2、1 μL，按照色譜條件來進行測定，并記錄每組情況下得到的色譜圖。以進樣量(X)對峰面積的積分值(Y)進行線性回歸計算，在處理后得到其回歸方程。梓醇方程表達為 Y=53 554X －4012，r=0.999 8，線性范圍是0.102 ～ 1.020 μg;毛蕊花糖苷的方程表達為 Y=2.03 ×106X －1.78 ×104，r=0.999 6，線性范圍是0.204 ～2.04 μg。

2.6 重復性實驗 精密稱取同一樣品(批號:120712)共5份，按含量測定項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件注入液相色譜儀，計算梓醇和毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.214 mg·g－1(RSD=0.86%);0.478 mg·g－1(RSD=0.95%)。表明本測定法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗 精密吸取依法制備的同一供試品溶液，在24 h內(nèi)每隔2 h重復進樣，共12次，每次10 μL，計算峰面積的相對標準編差分別為RSD=1.15%(n=12)、RSD=1.26%(n=12)。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 精密度實驗 取適量供試品溶液，進行6次重復進樣實驗，最后得出梓醇峰面面積 RSD=0.45%，毛蕊花糖苷峰面面積 RSD=0.56%，實驗結(jié)果說明該方法有著良好的實驗精密度。

2.9 加樣回收率實驗 取已知含量的供試品(批號120806)，平行6份，分別精密加入毛蕊花糖苷以及梓醇對照品適量，按供試品溶液的制備方法處理。測定各含量，結(jié)果見表1和表2。可見用此法測定毛蕊花糖苷和梓醇含量加樣回收率良好，方法準確、可靠。

表1 梓醇加樣回收率實驗(n=6)

表2 毛蕊花糖苷加樣回收率實驗(n=6)

2.10 樣品測定 從養(yǎng)血安神片中選取不同的3批次藥品，將適量的藥物粉碎后各取1g，經(jīng)過精密稱定后，依據(jù)2.2.2項下介紹的溶液制備處理方法進行溶液配制，同時將得到的溶液依據(jù)2.1項下的色譜條件的測定，得到的數(shù)據(jù)含量如表3所示。

表3 養(yǎng)血安神片含量測定(n=3)

3 討論

3.1 實驗中測定波長的選擇 查閱有關資料信息得知毛蕊花糖苷和梓醇吸收波長最為明顯的位置為210 nm以及337 nm處。且梓醇在337 nm波長處沒有明顯的吸收表現(xiàn)，同時210 nm處的毛蕊花糖苷也幾乎看不出有任何改變。故而在210 nm的波長位置選擇進行實驗檢查。

3.2 選擇合適的提取條件［4－6］筆者在進行實驗之前曾經(jīng)對甲醇回流最初3 h提取;對飽和正丁醇進行3 h回流提取;利用超聲對水飽和正丁醇進行40 min處理;在進行水溶解后對水飽和正丁醇實行4次萃取等方法從各方面進行了綜合比較，對比結(jié)果顯示用超聲對甲醇進行處理最終會有最高含量的提取，之后又進行了不同時間對甲醇的超聲處理比較，實驗結(jié)果證實在40 min的時候?qū)θ芤禾崛】梢垣@得最高含量的效果。

3.3 合理選擇色譜方法和梯度條件 試驗中參考中國藥典2010年版中對于地黃含量的測定方法，在討論分析之后發(fā)現(xiàn)藥典中毛蕊花糖苷以及梓醇的含量測定中流動相成分一致，但比例不同，所以考慮用梯度洗脫，筆者綜合考查了不同流動相以及不同梯度條件下混合液的色譜情況，曾選擇0.5%冰醋酸－甲醇(58∶42)、甲醇－乙腈－1%冰醋酸(15∶10∶75)、0.1%并存算－乙腈梯度洗脫用作流動相，得到的實驗結(jié)果證實上述配比均不能夠達到良好的分離效果。最終在參考大量實驗文獻后，經(jīng)過溶液比例調(diào)整，得到1%冰醋酸－乙腈(87∶13)作為流動相，此時就會實現(xiàn)溶液良好的分離效果。可以用作實驗研究檢測。

文中筆者結(jié)合高效液相色譜法實現(xiàn)了對養(yǎng)血安神片中梓醇與毛蕊花糖苷的同步含量檢測，方法學檢驗證實有著良好的線性、精密度、重復性、重現(xiàn)性，并且檢測方法操作簡單方便，能夠?qū)崿F(xiàn)梓醇與毛蕊花糖苷的較好程度分離，因此本法可以選作為養(yǎng)血安神片質(zhì)量控制方法。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:133.

［2］ 張貴財，朱旭江，杜 興，等.HPLC法測定蘭州肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量［J］.中國藥事，2010，24(8):802 －803.

［3］ 李才堂，文 萍，郭琦麗.HPLC測定裸花紫珠藥材中毛蕊花糖苷的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(1):84 －85.

［4］ 霍燕嫻，鄧杏好.HPLC同時測定壯元益生丸中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應用，2009，3(15):14－15.

［5］ 丁立新，王心合，杜永祥.高效液相色譜法測定桂花中毛蕊花苷的含量［J］.中國當代醫(yī)藥，2011，18(21):9 －10.

［6］ 吳 龍.反相高效液相色譜法測定地仲強骨膠囊中毛蕊花糖苷的含量［J］.中南藥學，2012，10(6):124 －125.