HPLC法測定益膽膠囊中甘草酸的含量

朱福海

(安徽醫科大學第二附屬醫院藥學部，安徽合肥 230601)

益膽膠囊由郁金、金銀花、白礬、甘草、硝石、滑石粉、玄參七味中藥組成，具有行氣散結、清熱通淋的作用。用于膽結石、腎結石、膀胱結石、阻塞性黃疸、膽囊炎等病見濕熱蘊結之證者。原質量標準中收載的含量測定為HPLC法測定綠原酸的含量，但綠原酸較不穩定，本文在原有標準的基礎上采用HPLC法測定益膽膠囊中甘草酸的含量，并進行方法學驗證，結果表明本方法簡便，專屬性強，準確，重復性好，可用于該制劑的質量控制［1－2］。

1 儀器與試藥

1.1 試藥 甘草酸銨對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110731－200205，供含量測定用);甲醇(色譜純);水(重蒸水);其它試劑(分析純)，益膽膠囊(批號:1207301、1207302、1207303)及陰性制劑均由合肥迪爾醫藥生物工程有限公司提供。

1.2 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀;AD－2型百萬分之一電子天平(美國PE公司);BS124S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯);DL－180J型超聲清洗器(上海之信儀器)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.2 mol·L－1醋酸銨溶液 － 冰醋酸(67∶33∶1);檢測波長:250 nm;柱溫:25℃;流量:1 mL·min－1［3－5］。在此條件下，甘草酸與其它組分能達到基線分離，系統適用性試驗理論板數按甘草酸峰計算:n=4 569，不低于2 000。分離度:R=4.88(R ＞1.5)，符合藥典規定。拖尾因子:T=0.99(0.95≤T≤1.05)，符合藥典規定。供試品中甘草酸所對應的峰保留時間與對照品峰保留時間一致，而陰性空白無干擾。結果見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 取甘草酸銨對照品約2.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1036 g·L－1的甘草酸銨對照品溶液(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.020 7)。

2.3 供試品溶液的制備 取本品內容物，研細過四號篩，精密稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，具塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率 40 kHz)30 min，取出，放冷，稱重，加70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性空白溶液的制備 取缺甘草的陰性樣品，按“2.3供試品溶液的制備”項下的方法制備缺甘草陰性空白溶液。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關系考察 分別精密吸取上述甘草酸銨對照品溶液(0.103 6 g·L－1)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL分別置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取20 μL，依次注入液相色譜儀中，依法測定。并以甘草酸的濃度(C)為橫坐標，相應的峰面積積分值(A)為縱坐標，得線性回歸方程:A=13.175C+7.786 9(r=0.999 9，n=6)，結果表明:甘草酸對照品濃度在 10.15～101.50 mg·L－1范圍內呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20 μL，依法進樣，連續測定5次，測得峰面積值為522、536、529、521、524，得峰面積的 RSD 為 1.18%。結果表明本法精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于制備 0，2，4，6，8 h 后，分別依法進樣，測得峰面積值為 532、530、525、519、536，得峰面積的RSD為1.25%。結果表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.8 重現性實驗 取同一批樣品5份，按“2.3供試品溶液的制備”項下的方法制備溶液，并按“2.1色譜條件”項下色譜條件依法進樣20 μL，測定甘草酸含量。結果測得甘草酸含量為 0.52、0.52、0.53、0.53、0.54 mg/粒，即平均含量為 0.53 mg/粒，得甘草酸含量的RSD為1.49%。

2.9 回收率試驗 取已知含量樣品6份(含甘草酸0.53 mg/粒)，精密稱定 0.5 g ，分別置 25 mL 量瓶中，精密加入一定量的甘草酸對照品，按“2.3供試品溶液的制備”項下的方法制備溶液。并按“2.1色譜條件”項下色譜條件依法進樣20 μL，測定甘草酸含量。結果見表1。平均回收率97.54%，RSD 0.64%。

表1 回收率測定結果

2.10 樣品測定 取三批(批號:1207301、1207302、1207303)，按“2.3供試品溶液的制備”項下的方法制備溶液，并按“2.1色譜條件”項下色譜條件依法進樣20 μL，測定甘草酸含量。結果得含量分別為0.43、0.43、0.44 mg/粒。

3 討論

本實驗研究的益膽膠囊，原來選用處方中的金銀花活性成分綠原酸為指標成分，為完善益膽膠囊的質量控制標準，另選用處方中的甘草活性三萜類成分甘草酸［6－10］作為增加的含測指標;在色譜條件的選擇上，在流動相中添加醋酸－醋酸銨緩沖溶液，以保證甘草酸的穩定性及色譜峰的峰型;同時對甘草酸對照品溶液進行紫外掃描，發現在250 nm處有最大吸收，故選擇250 nm作為測定波長，并沒有使用2010年藥典中的檢測波長237 nm。

本實驗在制備供試品溶液時，對提取溶媒進行了篩選，分別比較了稀乙醇、甲醇、50%甲醇，70%乙醇及流動相，結果以70%乙醇提取效率高，故在供試品制備過程中使用提70%乙醇作為提取溶媒。

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