枸地氯雷他定抗過敏性炎癥作用實驗研究

何廣衛，儲昭興，李家明

(1.合肥醫工醫藥有限公司，安徽合肥 230601;2.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230032)

過敏性疾病為臨床常見病，現已成為世界上幾乎所有國家的主要健康問題，被稱為21世紀的疾病［1］。其發病機制主要涉及I型和Ⅳ型變態反應，組胺是引起過敏發生的最主要介質，其次為白三烯、前列腺素和白介素等。研究表明過敏性疾病后期多伴隨炎癥，如IL-5、TNF-α在哮喘和/或鼻炎的致病中發揮著重要作用［2］;IL-4、IL-10等炎癥因子等參與過敏性哮喘的發病機制［3］;組胺與過敏性紫癜的發病機制有關［4］，也是I型過敏反應中最為重要的生物活性物質［5］;而PGE2和LTB4作為免疫細胞釋放的重要炎癥介質，還具有重要的免疫調節功能［6］。枸地氯雷他定(8-氯-6，11-二氫-11-(4-亞哌啶基)-5H-苯并［5－6］環庚［1，2-b］吡啶枸櫞酸氫二鈉鹽二水合物)為新一代組胺H1受體拮抗劑，臨床抗過敏療效確切、毒副作用小，本文主要通過體外實驗初步考察其對過敏后續的炎癥反應的影響作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 枸地氯雷他定(南京海辰藥業有限公司，批號:20121001)、依巴斯汀(武漢嘉凱隆科技發展有限公司批號:20111002)、鹽酸左西替利嗪(武漢嘉凱隆科技發展有限公司，批號:20120722)、地塞米松注射液(辰欣藥業股份有限公司，批號:1301251)，臨用前均用1640細胞培養液溶解至所需濃度;RPMI1640培養液(吉諾生物醫藥技術有限公司，批號:20121228);類標準胎牛血清FCS(民海生物工程有限公司，批號:120618);卵蛋白OVA(Sigma公司，批號:A5253);PGE2及 LTB4ELISA試劑盒(南京凱基生物技術有限公司，批號:KGEM051，KGEM041);TNF-α、IL-4、IL-5 及 LTB4ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司，批號:EK0527，EK0405，EK0408)。

1.2 實驗動物 ICR小鼠，雌雄各半，5～6周齡，體重(20±2)g，由浙江省醫學科學院提供［合格證號:SYXK(浙)2008－0033］。

1.3 實驗儀器 恒溫培養箱NUAIR-NU-5510E(上海凌儀實業有限公司);生物安全柜BSC1300(上海博迅);酶標儀Spectramax M2e(美國Molecular Devices公司);倒置顯微鏡DMI3000B(德國Leica公司)。

1.4 實驗方法［7］

1.4.1 致敏小鼠模型的構建及脾淋巴細胞的分離實驗第1天于小鼠腹腔注射含卵蛋白(OVA)100 μg及氫氧化鋁4 mg的0.9%NaCl注射液0.2 mL，第15天再次腹腔注射0.2 mL 0.9%NaCl注射液(含OVA 100 μg)構建OVA致敏的小鼠模型，第2次注射24 h后小鼠斷頸放血。小鼠于75%酒精內浸泡3 min，無菌條件下取小鼠脾臟，手術剪剪碎后加50倍量0.5%胰酶，于37℃振蕩消化15 min，過200目濾網，制備脾細胞懸液。用1640培養液調整細胞為2×106mL－1，加于24孔細胞培養板中，每孔1.5 mL。加各待測藥物前于培養箱內靜置12 h，待淋巴細胞沉于底部后，小心移去培養液，重新加新鮮培養液1 mL。

1.4.2 各待測藥物對小鼠致敏脾淋巴細胞的預處理 枸地氯雷他定、鹽酸左西替利嗪及地塞米松注射液用1640細胞培養液(含10%胎牛血清)稀釋至所需濃度，0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，依巴斯汀加DMSO助溶后稀釋至所需濃度。枸地氯雷他定、依巴斯汀、鹽酸左西替利嗪在各組淋巴細胞懸液中的終濃度分別為 0.15、1.5、15 μmol·L－1，地塞米松為1.5 μmol·L－1，DMSO 最終濃度 0.1%，共12 組，每組3個復孔。各組藥物預處理后，加OVA(終濃度分別為200 mg·L－1)進行刺激，與37℃、5%CO2培養箱中孵育。

1.4.3 細胞培養上清液中各炎癥因子釋放水平的檢測 以各組藥物及OVA預處理后，孵育2 h，離心，收集培養上清液，以 ELISA法檢測 LTB4及PGE2的水平;孵育9 h后收集培養上清液，ELISA法檢測TNF-α水平;孵育36 h后收集培養上清液，ELISA法檢測IL-4及IL-5水平，具體操作按照說明書進行。

2 結果

2.1 小鼠脾淋巴細胞經OVA刺激后LTB4、PGE2、IL-4、IL-5及TNF-α的表達 OVA致敏小鼠的脾淋巴細胞經OVA 再次刺激后，其LTB4、PGE2、IL-4、IL-5及TNF-α水平均高于正常對照組小鼠(P值均＜0.01)，見表1、表2，提示模型成功。

2.2 藥物預處理后對 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及TNF-α釋放的影響 以不同濃度的枸地氯雷他定對致敏淋巴細胞進行預處理后，淋巴細胞培養上清的 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 水平均受到不同程度抑制，且其抑制程度隨藥物濃度的增加而增加，說明枸地氯雷他定對致敏小鼠淋巴細胞釋放LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 具有抑制效應并存在濃度依賴性。同時DMSO預處理組小鼠脾淋巴細胞培養上清的各炎癥因子與正常對照組無明顯差異，故可排除DMSO對炎癥因子的非特異性抑制效應。

在相同作用濃度下，地塞米松抗炎活性最強，枸地氯雷他定高濃度組可獲得與地塞米松相當的活性，與鹽酸左西替利嗪和依巴斯汀相比，對PGE2釋放的抑制作用枸地氯雷他定＞鹽酸左西替利嗪＞依巴斯汀;對LTB4釋放的抑制作用鹽酸左西替利嗪＞枸地氯雷他定＞依巴斯汀;對TNF-α釋放的抑制作用枸地氯雷他定＞鹽酸左西替利嗪及依巴斯汀;三者對遲發相炎癥因子IL-4及IL-5的釋放均有顯著抑制作用。見表1、2。

3 討論

過敏性疾病亦稱為變態反應性疾病，主要包括蕁麻疹、過敏性鼻炎等，國內外流行病學資料表明，約有1/3以上的人一生曾患過敏性疾病，嚴重影響人們的生活質量、工作和學習，造成巨大的經濟損失［8］，其病理生理過程中有炎癥因子的參與，過去未對抗過敏藥物是否具有抗炎癥活性進行明確研究，但在近期的文獻報道中越來越多的被涉及到，尤其是針對呼吸系統疾病如過敏炎癥性哮喘等。

研究證明抗過敏藥物孟魯斯特和地塞米松均可通過抑制受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)、NF-KB等因子在氣道末梢軟組織的表達，降低嗜酸性粒細胞，從而改善OVA誘導的呼吸系統過敏性炎癥豚鼠癥狀［9］;而阻斷組胺H1受體可抑制骨髓系樹突細胞(Bone-marrow Dendritic cells)IL-6和TNF-α表達，激活H1受體可以誘導TNF-α過表達，因此，H1受體已被證實與過敏性炎癥有關［10］。

表1 枸地氯雷他定對OVA致敏小鼠淋巴細胞炎癥因子IL-4、IL-5及TNF-α釋放的影響(±s，n=3)

表1 枸地氯雷他定對OVA致敏小鼠淋巴細胞炎癥因子IL-4、IL-5及TNF-α釋放的影響(±s，n=3)

注:與正常組比較，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 IL-4/ng·L－1 IL-5/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 32.88 ±8.35 22.40 ±3.86 86.86 ±10.77模型 104.19±20.75△△ 61.72±9.00△△ 306.39±33.08△△△地塞米松/μmol·L －1 1.5 46.71 ±6.70＊＊ 30.50 ±4.03＊＊ 199.70 ±20.57＊＊枸地氯雷他定/μmol·L －1 0.15 76.02 ±12.49 53.37 ±5.52 254.83 ±18.48 1.5 58.96 ±8.04* 45.74 ±5.42 187.76 ±37.88*15 55.73 ±4.67* 33.62 ±3.79＊＊ 183.12 ±28.30＊＊依巴斯汀/μmol·L －1 0.15 95.78 ±4.99 55.62 ±7.23 294.59 ±42.25 1.5 71.56 ±9.67 38.78 ±3.82* 264.23 ±51.58 15 51.56 ±6.00* 34.89 ±5.26＊＊ 247.71 ±43.28鹽酸左西替利嗪/μmol·L－1 0.15 96.26 ±8.58 49.56 ±5.78 270.61 ±40.19 1.5 59.56 ±5.45* 44.51 ±3.15* 239.29 ±26.17 15 55.44 ±7.49* 40.04 ±5.94*正常244.68 ±44.48

表2 枸地氯雷他定對OVA致敏小鼠淋巴細胞炎癥因子PGE2及LTB4釋放的影響(±s，n=3)

表2 枸地氯雷他定對OVA致敏小鼠淋巴細胞炎癥因子PGE2及LTB4釋放的影響(±s，n=3)

注:與正常組比較，△△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 PGE2/ng·L－1 LTB4/ng·L －1 51.02 ±10.85 43.23 ±8.48模型 214.35 ±36.56△△ 178.93 ±41.99△△地塞米松 1.5 μmol·L－1 77.27 ±20.84＊＊ 57.72 ±5.61＊＊枸地氯雷他定/μmol·L －1 0.15 144.65 ±14.64* 128.70 ±12.40 1.5 124.50 ±18.73* 112.8 ±15.06 15 82.00 ±15.29＊＊ 94.08 ±11.20*依巴斯汀/μmol·L－1 0.15 199.63 ±16.31 163.31 ±20.46 1.5 179.60 ±18.46 148.18 ±14.79 15 161.46 ±16.21 108.45 ±13.80*鹽酸左西替利嗪/μmol·L －1 0.15 185.34 ±17.43 124.18 ±14.79 1.5 159.60 ±22.88 106.34 ±15.60*15 130.61 ±13.14* 76.84 ±15.27正常*

枸地氯雷他定為H1受體拮抗劑，臨床應用于急慢性蕁麻疹、過敏性鼻炎等疾病，具有顯著療效，口服吸收快，起效時間短，半衰期長，作用持久且副作用較小，其中樞神經系統的抑制作用發生率較低，主要為口干和嗜睡現象發生［11］。最新研究發現，枸地氯雷他定臨床上對老年性皮膚瘙癢［12］和面部皮炎［13］等炎癥相關性疾病有顯著治療作用。

本文主要通過小鼠腹腔注射卵蛋白聯合氫氧化鋁膠體構建致敏動物模型，分離并培養小鼠脾淋巴細胞，考察枸地氯雷他定對 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥相關因子的影響，探討枸地氯雷他定體外抗過敏性炎癥活性，并與依巴斯汀、鹽酸左西替利嗪等同類藥進行比較，為深入研究及證明枸地氯雷他定具有抗炎療效提供依據。實驗結果表明枸地氯雷他定不僅具有顯著的體外抗炎癥活性，在高濃度下還可獲得與地塞米松相當的抑制效果。與鹽酸左西替利嗪和依巴斯汀同類藥物相比較，枸地氯雷他定更具備早期抗炎癥的潛力。

對于枸地氯雷他定的抗過敏性炎癥作用，還需在更多炎癥模型上進一步驗證，并闡明其與RANTES、NF-KB等因子的相互作用機制關系，但本文實驗結果已證明其有在過敏性炎癥疾病，尤其是氣道過敏性炎癥疾病方面有應用潛力。

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