正交試驗(yàn)法優(yōu)選五味溫通除痹膠囊水提工藝

張玉婷，高家榮，劉 健，韓燕全，姜 輝，吳 健，劉 娟，羅 歡

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031)

五味溫通除痹膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科劉健教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的驗(yàn)方，處方由淫羊藿、茯苓、黃芩、片姜黃、桂枝等5味中藥組成;具有溫陽(yáng)通脈，散寒止痛的功效，主要治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨關(guān)節(jié)炎、寒濕痹阻型所致的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，畏寒怕冷等病癥［1－2］。為優(yōu)化其制備工藝，本試驗(yàn)采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，通過(guò)對(duì)水提工藝影響較大的因素如提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水量等因素進(jìn)行考察。由于淫羊藿是方中的君藥，故以淫羊藿苷提取率、浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，優(yōu)選出該制劑的最佳水提工藝，為優(yōu)化其制備工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower2數(shù)據(jù)處理工作站;BP211D電子天平(德國(guó)塞多利斯公司);PTHW型調(diào)溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);HH－S型水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);真空干燥箱(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司);KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對(duì)照品(含量測(cè)定用，批號(hào)110737－200312)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;處方藥材飲片均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)李立華主任中藥師鑒定均符合《中國(guó)藥典》(2010版)一部規(guī)定;甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)Tedia公司);水為屈臣氏蒸餾水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)本處方中君藥的主要有效成分的化學(xué)性質(zhì)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)方案，考察主要因素加水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)，以淫羊藿苷提取率、浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分(權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4)，優(yōu)選最佳水提工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

按處方配比稱取各藥材9份，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行加熱回流，合并提取液、濾過(guò)，減壓濃縮，備用。

2.2 淫羊藿苷含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Acquity BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:乙腈 － 水(27∶73);柱溫:22℃;流速:0.2 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;進(jìn)樣量:1.0 μL。見(jiàn)圖1。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密加入甲醇制成含淫羊藿苷0.16 g·L－1的對(duì)照品溶液母液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 將干浸膏研成粉末，過(guò)60目篩，稱定1 g置錐形瓶中，加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 Hz)1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液及原藥材溶液的制備按處方比例，取除淫羊藿外的其他藥材，按照制劑工藝制成干浸膏，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。另取淫羊藿粉末0.5 g，按“2.2.3”項(xiàng)下配制原藥材溶液，備用。

圖1 UPLC色譜圖

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將淫羊藿苷對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，由圖1可知，淫羊藿苷保留時(shí)間約在5.40 min，其色譜峰與其相鄰峰達(dá)到完全基線分離，對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同位置有對(duì)應(yīng)的色譜峰，陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置無(wú)干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別將母液用甲醇稀釋成0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160 g·L－1濃度的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=30 108 528.08X －94 023.65，r=0.999 9。結(jié)果表明，淫羊藿苷在 0.016 ～0.160 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取淫羊藿苷對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，RSD為1.82%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取正交試驗(yàn)第5組供試品溶液，分別在第0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定峰面積，RSD 值為4.09%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取正交試驗(yàn)第5組樣品浸膏，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，RSD值為1.89%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的樣品，加入淫羊藿苷對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 浸膏得率的測(cè)定 將“2.1”項(xiàng)下9份稠浸膏置干燥箱中，70℃減壓干燥至恒重，移至干燥器中冷卻30 min，迅速稱重。計(jì)算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏重量/原藥材的重量×100%。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 以淫羊藿苷提取率及浸膏得率為指標(biāo)，考察水提工藝，正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)安排L9(34)及結(jié)果考察

表4 方差分析結(jié)果

2.5 最佳工藝確定 以以淫羊藿苷提取率和浸膏得率為指標(biāo)，綜合評(píng)分結(jié)果顯示，由各因素水平直觀分析的K值高低可以得出影響水提效果的因素主次為C＞A＞B，最優(yōu)水平組合為A3B3C3。方差分析結(jié)果表明，因素C(提取次數(shù))對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響有顯著性意義(P＜0.05)，而因素 A(加水量)、B(提取時(shí)間)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響無(wú)顯著性意義。由于在實(shí)際生產(chǎn)中，從節(jié)約時(shí)間及能源，提高生產(chǎn)效率，以及生產(chǎn)的可行性等角度綜合考慮，制定最佳提取工藝為加10倍水，提取3次，每次1.0 h。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方配比，取與正交試驗(yàn)同批次的藥材共3份，分別加10倍水，提取3次，每次1.0 h。平行測(cè)定3次，經(jīng)計(jì)算淫羊藿苷的提取率為(74.59 ±2.32)%，浸膏得率為(15.87 ±0.27)%。由驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選的條件穩(wěn)定、可靠、有效成分提取率較高。

3 討論

淫羊藿作為方中的君藥，其主要活性成分為淫羊藿苷，可溶于水，甲醇，乙醇等溶劑，故可以用水提法，乙醇回流法等方法提取［3－11］。本試驗(yàn)為了降低成本，便于制劑大批量生產(chǎn)，故采用具有應(yīng)用廣泛、裝置簡(jiǎn)單的傳統(tǒng)水提法。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，大都采用HPLC法測(cè)含量［12－14］，本實(shí)驗(yàn)首次建立了UPLC法測(cè)定淫羊藿苷提取率的方法，采用乙腈 － 水(27∶73)為流動(dòng)相，較藥典［15］的梯度洗脫更節(jié)約溶劑，此方法所用時(shí)間為16 min，較藥典的55 min，大大的節(jié)省了測(cè)定時(shí)間。在保持較高的準(zhǔn)確度和精密度的同時(shí)，提高了分離效率，減少了溶劑的損耗，縮短了測(cè)定時(shí)間，為該制劑的質(zhì)量控制提供了一種更為快速準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)，通過(guò)綜合評(píng)分法，優(yōu)選出的提取工藝更具有科學(xué)性和合理性，對(duì)提取工藝的研究有著積極的指導(dǎo)意義，也是進(jìn)行工藝篩選評(píng)價(jià)的一個(gè)可行模式。該水提工藝設(shè)計(jì)合理，可為五味溫通除痹膠囊的研制提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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