銀屑病患者血清白介素36及其受體拮抗劑表達水平與病情嚴重度的相關性研究

舒丹 晉紅中 王寶璽 蘇飛 李峰

銀屑病患者血清白介素36及其受體拮抗劑表達水平與病情嚴重度的相關性研究

舒丹 晉紅中 王寶璽 蘇飛 李峰

目的探討銀屑病患者血清白介素(IL)36(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)及其受體拮抗劑IL-36Ra水平與銀屑病病情嚴重度的相關性。方法采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)比較45例泛發性膿疤性銀屑病(GPP)患者、34例尋常性銀屑病(PV)患者和37例健康對照者血清IL-36及IL-36Ra水平,并結合患者病情嚴重度進行相關性分析。結果IL-36及IL-36Ra在3組之間表達差異無統計學意義。銀屑病患者按病期分組后,GPP膿疤發作期患者27例血清IL-36β、γ表達水平(中位數±四分位數間距分別為12.101±11.315和34.541±15.580 ng/L)顯著高于健康對照組(分別為5.355±9.020和23.052±22.410 ng/L),經非參數Mann-Whiteney檢驗,差異均有統計學意義(P＜0.05)。按病情嚴重度分組后,重度GPP患者7例血清IL-36β、γ表達水平(分別為11.218±9.318和38.536±17.332 ng/L)均顯著高于健康對照組(P＜0.01)。GPP組、PV組及健康對照組IL-36β與γ表達水平均呈顯著正相關(r值分別為0.85、0.86、0.91,均P＜0.01);且兩者均與GPP病情嚴重度呈低度正相關(r值分別為0.33、0.41,均P＜0.05);IL-36β表達水平尚與PV皮損面積嚴重指數顯著正相關(r=0.54,P＜0.01)。結論GPP患者血清IL-36β、γ水平與病情嚴重度呈低度正相關,提示IL-36β、γ可能在GPP的發病中發揮重要作用。

銀屑病;白細胞介素36;白細胞介素36受體拮抗劑

近年研究發現,白介素(IL)36及其受體拮抗劑IL-36Ra與銀屑病的發病密切相關,IL-36能啟動皮膚中抗菌肽的表達,從而激活銀屑病樣基因的表達,引起銀屑病的發生[1]。IL-36RN(編碼IL-36Ra的基因)突變可導致泛發性膿疤性銀屑病(GPP)的發生[2-4]。IL-36及IL-36Ra主要由角質形成細胞產生,在皮損局部發揮作用[5],是否IL-36及IL-36Ra在GPP、尋常性銀屑病(PV)患者血清中也發揮作用?其水平與病情是否相關?本研究通過檢測GPP、PV患者及健康人血清中IL-36及IL-36Ra表達水平,分析其與病情嚴重度的相關性,探討其在銀屑病發病機制中的作用。

資料與方法

一、臨床資料

選取我科2012年1月至2013年10月經臨床或病理確診的45例GPP和34例PV患者。GPP組男28例,女17例,年齡5～66歲,中位年齡28.5歲;PV組男19例,女15例,年齡6～65歲,中位年齡29.0歲。GPP患者均符合Umezawa診斷標準[6],入組時根據膿疤情況分為膿疤發作期(有新發膿疤,伴或不伴發熱)27例、膿疤消退期(無新發膿疤、發熱,膿疤部分消退或完全消退)18例;根據Umezawa[6]病情評估標準,分為輕度(0～2分)18例、中度(3～6分)20例、重度(7～10分)7例。

PV患者均符合診斷標準[7],進展期20例,非進展期14例;根據皮損面積嚴重指數(PASI)標準[8],分為輕度(PASI＜7)14例,中重度(PASI≥ 7)20例。所有患者無其他系統性或免疫性疾病,2周內未系統性應用糖皮質激素、維A酸制劑、免疫抑制劑及生物制劑治療。健康對照組37例,其中男22例,女15例,年齡6～68歲,中位年齡30.2歲。經統計學分析,3組間在年齡、性別方面差異均無統計學意義。本研究經北京協和醫院倫理委員會批準,所有患者及健康對照者均簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

人 IL-36α、IL-36β、IL-36γ及IL-36Ra試劑盒產自上海延吉生物科技有限公司,Synergy Hybrid酶標儀由美國Biotek公司生產。

三、方法

征得患者知情同意后,填寫臨床資料存檔,記錄GPP患者病情評分及PV患者PASI,采集肘正中靜脈血4 ml,分離血清,分裝后放-80℃冰箱保存待測。

1.IL-36、IL-36Ra檢測:采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中IL-36、IL-36Ra水平,具體操作按照說明書進行。將加樣板置于波長450 nm酶標儀讀取各孔吸光度(A值),并建立標準曲線,按曲線方程計算各樣本濃度。敏感度:IL-36α＜0.1 ng/L,IL-36β、γ 及Ra均 ＜1.0 ng/L。 變異系數:板內、板間均＜15%。

2.統計學方法:采用SPSS 17.0統計軟件進行處理,數據非正態分布,檢驗結果以中位數±四分位數間距表示,GPP、PV組間及與健康對照組間比較采用非參數Mann-Whiteney檢驗,患者血清IL-36、IL-36Ra水平之間及其與病情嚴重度的相關性比較采用Spearman等級相關檢驗(秩和檢驗)。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者和健康人血清IL-36、IL-36Ra表達水平

GPP組、PV組分別與健康對照組比較及GPP組與PV組比較,血清IL-36及IL-36Ra水平差異均無統計學意義(均P＞0.05)。見表1。

表1 泛發性膿疤性銀屑病(GPP)和尋常性銀屑病(PV)患者血清白介素36(IL-36)及其受體拮抗劑(IL-36Ra)表達水平(中位數±四分位數間距) ng/L

二、按病期分組后患者和健康人血清IL-36、IL-36Ra表達水平

GPP膿疤發作期患者血清IL-36β、γ表達水平顯著高于健康對照組、GPP膿疤消退期及PV非進展期,GPP膿疤發作期IL-36β與各組比較Z值分別為3.58、4.17、3.66,IL-36γ與各組比較Z值分別為2.70、4.32、3.22,均P＜0.01。 GPP膿疤發作期患者血清IL-36β表達水平高于PV進展期(Z=2.58,P＜0.05)。其余細胞因子血清表達水平在GPP、PV患者各分期組間差異均無統計學意義(均P＞0.05),與健康對照組相比差異也均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

三、按病情嚴重度分組后患者IL-36、IL-36Ra表達水平

中度、重度GPP患者血清IL-36β表達水平高于健康對照組(Z值分別為2.40、2.20,均P＜0.05)。重度GPP患者血清IL-36β表達水平高于輕度PV患者(Z=2.78,P＜0.01),血清IL-36γ表達水平高于健康對照組、輕度GPP患者及輕度PV患者(Z值分別為 2.00、2.66、2.71,P值分別 ＜ 0.05、＜ 0.01、＜0.01)。其余細胞因子血清表達水平在GPP、PV患者不同病情組間差異均無統計學意義(P＞0.05),與健康對照組相比差異亦均無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 不同病情泛發性膿疤性銀屑病(GPP)和尋常性銀屑病(PV)患者血清白介素36(IL-36)及其受體拮抗劑(IL-36Ra)表達水平(中位數±四分位數) ng/L

四、相關性分析

1.銀屑病患者血清IL-36、IL-36Ra表達水平的相關性分析:GPP、PV組患者及健康對照組血清中IL-36β與γ表達水平均呈高度正相關(r值分別為0.85、0.86、0.91,均P＜0.01)。PV患者血清中IL-36α與β表達水平呈顯著正相關(r=0.70,P＜0.01),IL-36α與γ高度正相關(r=0.82,P＜0.01),IL-36α與Ra低度負相關(r=-0.38,P＜0.05)。而健康對照組血清中IL-36α與β表達水平呈顯著正相關(r=0.58,P＜0.01),IL-36α與γ低度正相關(r=0.48,P＜0.01)。其余細胞因子表達水平在患者及健康對照組血清中均無顯著相關性(均r＜0.3,P＞0.05)。

2.銀屑病患者血清IL-36、IL-36Ra表達水平與病情嚴重度的相關性分析:GPP組患者IL-36β、γ血清表達水平均與病情嚴重度呈低度正相關(r值分別為0.33、0.41,均P＜0.05)。PV組患者PASI與IL-36α血清表達水平呈低度正相關(r=0.44,P＜0.01),與IL-36β顯著正相關(r=0.54,P＜0.01),與IL-36γ低度正相關(r=0.40,P＜0.05)。其余細胞因子水平與病情嚴重度均無相關(均r＜0.30,P＞0.05)。

討 論

IL-36是IL-1家族成員,由3個生物學功能相似的分子 IL-36α、IL-36β 及 IL-36γ組成[1,9]。IL-36在體內需通過與特異性受體IL-36R(曾稱為IL-1Rrp2或IL-1RL2)結合而發揮促炎癥作用,而IL-36Ra是其受體拮抗劑。IL-36和IL-36R、IL-36Ra主要在上皮組織如皮膚、氣管、食道中表達[5]。角質形成細胞、單核細胞和B細胞受刺激后活化可產生IL-36[5]。 IL-36、IL-36R與IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)組成一條新的IL-1家族的信號傳導通路,啟動靶基因的表達,發揮促炎癥作用,IL-36Ra與IL-36R結合后的復合物不能再與IL-1RAcP結合,從而不能激活信號轉導通路而起到抗炎癥作用[1,9]。IL-36及IL-36Ra與銀屑病的發病密切相關,IL-36α轉基因小鼠皮膚中IL-36α過度表達,出現皮膚增厚、表面多層鱗屑,組織病理表現為棘層肥厚、真皮內炎細胞浸潤,與人銀屑病皮損相似,且皮損中 IL-17、IL-22、IL-23、抗菌肽等銀屑病相關基因表達增多[10]。缺失IL36RN的IL-36α轉基因鼠病死率高,皮膚產生廣泛膿疤,組織病理學表現為表皮內膿疤[10],與人GPP臨床表現相似。PV患者皮損中IL-36、IL-36Ra表達及其mRNA合成顯著增加[1,11-12],PV患者皮損的維持需要IL-36持續表達[12],經腫瘤壞死因子α(TNF-α)治療后的PV患者皮損中IL-36、IL-36Ra表達顯著減少[1]。GPP患者存在IL36RN突變[2-4],突變IL36RN所產生的異常IL-36Ra量很少,且不能拮抗IL-36的作用,導致炎癥因子在患者皮損中過度表達,可能為GPP的發病機制之一[4]。

我們采用ELISA法對GPP、PV組患者及健康對照組血中IL-36、IL-36Ra水平進行檢測,結果顯示,IL-36及IL-36Ra在3組之間表達無差異,按病期分組后IL-36β、γ表達水平在GPP膿疤發作期顯著升高,按病情嚴重度分組后IL-36β、γ表達水平在重度GPP患者顯著升高。相關性分析結果顯示,IL-36β與γ表達水平在GPP、PV及健康對照組中均呈高度正相關,且兩者均與GPP病情嚴重度呈低度正相關。以上研究結果提示,IL-36β與γ在GPP患者血清中可能有相似的生物學活性,其水平的升高是GPP發病機制的重要組成部分,可能參與GPP的發生及發展過程。而IL-36α、Ra血清表達水平在3組間無異常,且與病情嚴重度無關,然而IL-36α與β、γ表達水平在健康對照者及PV患者呈不同程度的正相關,而在GPP患者中則無相關,提示IL-36α在銀屑病患者血清中的作用機制可能與IL-36β、γ稍有差異,具體機制尚待進一步研究。IL-36Ra是否在銀屑病患者血清中參與發病,本文尚不能證實。由于其所拮抗的炎癥因子如IL-36β、γ等在GPP發作期及重度GPP患者中顯著升高,結合GPP患者存在IL36RN突變[6-8],且異常IL-36Ra不能拮抗IL-36作用這一理論,推測血清中IL-36Ra在GPP患者中可能參與發病。鑒于ELISA法并不能區分異常、正常IL-36Ra,且僅部分GPP存在IL36RN突變,最終GPP患者并未出現血清IL-36Ra表達水平的顯著降低。關于IL-36Ra在銀屑病發病中的作用需進一步行IL36RN基因檢測、體外功能試驗。

雖然PV患者IL-36、IL-36Ra水平按病期、PASI分組后各組間并無差異,與健康對照組也無差異,但是IL-36α、β、γ與PASI呈不同程度的正相關,因此IL-36、IL-36Ra在PV患者血清中的作用機制尚需進一步證實。

綜上所述,血清中IL-36β、γ可能在GPP的發病過程中發揮重要作用,其水平與病情嚴重程度相關。其余IL-36相關細胞因子在銀屑病患者血清中的作用尚需擴大樣本量、豐富檢測方法以進一步證實。

[1]Johnston A,Xing X,Guzman AM,et al.IL-1F5,-F6,-F8,and-F9:a novel IL-1 family signaling system that is active in psoriasis and promotes keratinocyte antimicrobial peptide expression[J].J Immunol,2011,186(4):2613-2622.

[2]Marrakchi S,Guigue P,Renshaw BR,et al.Interleukin-36-receptor antagonist deficiency and generalized pustular psoriasis[J].N Engl J Med,2011,365(7):620-628.

[3]Onoufriadis A,Simpson MA,Pink AE,et al.Mutations in IL-36RN/IL1F5 are associated with the severe episodic inflammatory skin disease known as generalized pustular psoriasis[J].Am J Hum Genet,2011,89(3):432-437.

[4]Farooq M,Nakai H,Fujimoto A,et al.Mutation analysis of the IL36RN gene in 14 Japanese patients with generalized pustular psoriasis[J].Hum Mutat,2013,34(1):176-183.

[5]Kumar S,McDonnell PC,Lehr R,et al.Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family[J].J Biol Chem,2000,275(14):10308-10314.

[6]Umezawa Y,Ozawa A,Kawasima T,et al.Therapeutic guidelines for the treatment of generalized pustular psoriasis(GPP)based on a proposed classification of disease severity[J].Arch Dermatol Res,2003,295 Suppl 1:S43-54.

[7] 趙辨.中國臨床皮膚病學[M].南京:江蘇科學技術出版社,2010:1008-1025.

[8]Anderson KS,Petersson S,Wong J,et al.Elevation of serum epidermal growth factor and interleukin 1 receptor antagonist in active psoriasis vulgaris[J].Br J Dermatol,2010,163(5):1085-1089.

[9]Towne JE,Sims JE.IL-36 in psoriasis[J].Curr Opin Pharmacol,2012,12(4):486-490.

[10]Blumberg H,Dinh H,Trueblood ES,et al.Opposing activities of two novel members of the IL-1 ligand family regulate skin inflammation[J].J Exp Med,2007,204(11):2603-2614.

[11]Towne JE,Renshaw BR,Douangpanya J,et al.Interleukin-36(IL-36)ligands require processing for full agonist(IL-36α,IL-36β,and IL-36γ)or antagonist(IL-36Ra)activity[J].J Biol Chem,2011,286(49):42594-42602.

[12]Blumberg H,Dinh H,Dean C Jr,et al.IL-1RL2 and its ligands contribute to the cytokine network in psoriasis[J].J Immunol,2010,185(7):4354-4362.

2013-05-20)

(本文編輯:顏艷)

Serum levels of interleukin-36 and its receptor antagonist in patients with psoriasis and their correlations with disease severity

Shu Dan*,Jin Hongzhong,Wang Baoxi,Su Fei,Li Feng.*Department of Dermatology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China

s:Jin Hongzhong,Email:jinhongzhong@263.net;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

ObjectiveTo evaluate the relationship of serum levels of interleukin(IL)-36α,IL-36β and IL-36γ as well as their receptor antagonist IL-36Ra with disease severity in patients with psoriasis.MethodsVenous blood samples were collected from 45 patients with generalized pustular psoriasis(GPP),34 patients with psoriasis vulgaris(PV),and 37 healthy human controls.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the serum levels of IL-36α,IL-36β,IL-36γ and IL-36Ra.Nonparametric Mann-Whitney test was conducted to compare the levels of IL-36 and IL-36Ra among these groups,and Spearman's rank correlation analysis to assess the relationship between the serum levels of IL-36 and IL-36Ra and disease severity.ResultsNo statistical difference was observed in the serum levels of IL-36 or IL-36Ra among the patients withGPP,patients with PV,and healthy human controls.The serum levels of IL-36β and IL-36γ (given as the median±interquartile range)were significantly higher in 27 patients with GPP during episodes of pustules((12.101±11.315)ng/L and(34.541±15.580)ng/L respectively)and in 7 patients with severe GPP((11.218±9.318)ng/L and(38.536±17.332)ng/L respectively)than in the healthy human controls((5.355±9.020)ng/L and(23.052±22.410)ng/L respectively,P＜ 0.05 or 0.01).The serum level of IL-36γ was positively correlated with that of IL-36β in patients with GPP,patients with PV,and the healthy human controls(r=0.85,0.86,0.91,respectively,allP＜0.01),and both IL-36β and IL-36γ serum levels were lowly and positively correlated with the severity of GPP(r=0.33,0.41,respectively,bothP＜0.05).A positive correlation was also observed between the serum level of IL-36β and psoriasis area and severity index(PASI)scores in patients with PV(r=0.54,P＜0.01).ConclusionsThe serum levels of IL-36β and IL-36γ are lowly and positively correlated with disease severity in patients with GPP,suggesting that IL-36β and IL-36γ play an important role in the pathogenesis of GPP.

Psoriasis;Interleukin-36;Interleukin-36 receptor antagonist

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.005

衛生公益性行業科研專項經費(201002016)教育部博士點基金(20121106110047)

100730北京,中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院皮膚科(舒丹、晉紅中、蘇飛、李峰);中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所(王寶璽)

晉紅中,Email:jinhongzhong@263.net;王寶璽,Email:wangbx@ncstdlc.org