黃孢原毛平革菌脂肪合成現象的探討

楊益君 費婷

(杭州杭康衛生檢測技術有限公司,浙江杭州 310000)

黃孢原毛平革菌脂肪合成現象的探討

楊益君 費婷

(杭州杭康衛生檢測技術有限公司,浙江杭州 310000)

本文以土豆濾液配制Kirk培養基培養黃孢原毛平革菌,從定性方面研究其產脂規律。

黃孢原毛平革菌 脂肪含量

1 前言

20世紀80年代以來，國內外學者一直著眼于研究微生物產脂這一課題，其中細菌和真菌的產脂規律更是研究的熱點，本文以黃孢原毛平革菌(phanerovhaete chrysosporium Burd．)作為實驗對象，在定性方面，采用蘇丹黑B染色法，在顯微鏡下觀察黃孢原毛平革菌菌絲體內的脂肪粒，對黃孢原毛平革菌的脂肪合成代謝規律進行分析。

2 實驗材料

2.1 菌種來源

本研究選用的白腐真菌菌種為黃孢原毛平革菌(phanerovhaete chrysosporium Burd．)，由中國科學院微生物研究所菌種保藏中心提供。

2.2 培養基材

PDA培養基:稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎放入鍋中，加入1000ml純水，置于電爐上加熱，待沸騰后開始計時，30min后停止加熱。稍稍冷卻后，用紗布過濾，將上清液倒入事先準備好的500ml錐形瓶中。然后在高壓滅菌鍋(121℃，1．2大氣壓)中滅菌20min，滅菌后冷卻，放入冷藏柜，保存備用。移取400ml預制的土豆濾液，加入4g葡萄糖和10g瓊脂，充分溶解后在高壓滅菌鍋(121℃，1．2大氣壓)中滅菌20min，取出后倒入培養皿中，每個培養皿中倒入約15～20ml，冷卻凝固。

Kirk培養基:10g/L葡萄糖、0．221g/L酒石酸銨、2．0g/LKH2PO4、0．5g/LMgSO4·7H2O、0．132g/LCaCl2、1mg/LVB1及1ml/L微量元素、100mL醋酸緩沖劑(pH6．0)，以土豆濾液為溶劑，定容至1000ml。

2.3 實驗試劑

藏紅T；二甲苯；無水乙醇；鹽酸；乙醚；石油醚(30℃～60℃沸程)；葡萄糖；酒石酸銨；KH2PO4；CaCl2；MgSO4·7H2O；VB1；醋酸鈉；冰醋酸。以上化學試劑均為分析純。

2.4 實驗儀器設備

本實驗使用的主要實驗儀器:FL-107顯微鏡；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養箱；AB135-S梅特勒電子分析天平等。

3 實驗方法

3.1 黃孢原毛平革菌培養方法

圖1 黃孢原毛平革菌生物量變化

采用靜置培養方式，將配制的Kirk培養基分別裝入培養瓶中，每瓶培養瓶中裝50ml培養基，在高壓滅菌鍋(121℃，1．2大氣壓)中滅菌40 min。滅菌后，把培養瓶從高壓滅菌鍋中取出，待冷卻至室溫。采用打孔器(直徑1．0cm)在PDA培養基上打孔取黃孢原毛平革菌的菌塊，然后將菌塊接入培養瓶里，使菌塊漂浮在Kirk培養基表面。接種后將培養瓶放入溫度為25℃，濕度為65%的恒溫培養箱中培養。每個培養基設置4個平行樣。

3.2 生物量測定辦法

先把定量濾紙放到80℃的烘箱中烘至恒重，然后放到干燥器中冷卻到室溫稱重得質量m1。用布氏漏斗過濾分離菌球與培養基，濾出菌球后把濾紙及濾紙上的菌球放到40～60℃的干燥箱中烘至恒重。然后放到干燥器中冷卻到室溫稱重得質量m2。菌絲體干重

3.3 蘇丹黑B染色法

滴一滴蒸餾水于載玻片上，挑取少許菌絲體于其中進行熱固定。待冷卻后，加一滴0．3%蘇丹黑B染色液，自然干燥10～15min。再滴加二甲苯脫色直至洗出液透明。干燥后，番紅復染1～2min，水洗至洗出液透明。干燥后鏡檢，在光學顯微鏡(1600×)下觀察[2]。

3.4 脂肪含量測定方法

脂肪含量測定方法采用GB/T 5009．6-2003《食品中脂肪的測定》中的酸熱法[1]。

4 結果與分析

4.1 黃孢原毛平革菌產脂情況

4.1.1 黃孢原毛平革菌生物量的變化

在溫度為25℃，濕度為65%的培養箱中，用Kirk培養基培養黃孢原毛平革菌，觀察黃孢原毛平革菌的生長情況，并且測定其在不同培養時間的生物量，運用t檢驗分析數據間的顯著性差異，探討黃孢原毛平革菌生物量的變化趨勢，結果如圖1所示。

通過t檢驗，從圖1中發現第2、4、6、8、10天之間的生物量都具有顯著性差異(P＜0．05)，第10、12、14天之間的生物量沒有顯著性差異(P＞0．05)，可知第2、4、6、8天的生物量快速增長，第10天的生物量有所下降，而從第10天開始黃孢原毛平革菌的生物量基本不變，維持一個平穩的狀態。

由此得出，黃孢原毛平革菌在其生長過程中，初始階段生物量會有一個迅速增長的趨勢，第8天，黃孢原毛平革菌獲得了最大的生

圖2 黃孢原毛平革菌菌絲體中脂肪含量變化

物量，為0．5457g，而從第8天到第10天，生物量又會出現短時間的下降趨勢。從第10天開始，黃孢原毛平革菌的生物量基本保持不變。

4.1.2 黃孢原毛平革菌產脂量的變化

采用酸熱法來測定不同培養時間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量。通過測定菌絲體中的脂肪含量，運用t檢驗分析數據間的顯著性差異，來探討黃孢原毛平革菌在培養過程中是否存在脂肪的合成，并且分析其產脂規律。

如圖2所示，第6天，菌絲體中的脂肪含量達到最高值，即為16．29%。通過t檢驗，可以發現第2、4、6天之間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量有顯著性差異(P＜0．05)，得到第2、4、6天黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量呈上升趨勢。這可能是因為黃孢原毛平革菌的代謝發生歧化作用，進入了油脂合成階段。第6、8、10、12天之間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量也有顯著性差異(P＜0．05)，得到第6、8、10、12天黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量呈下降趨勢。其原因可能是由于培養基中的營養不足，以致于黃孢原毛平革菌以生成的脂肪作為能源來維持自身的生長。第12、14天之間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量沒有顯著性差異(P＞0．05)，從第12天開始，菌絲體中的脂肪含量維持一個平穩的狀態。

4.2 黃孢原毛平革菌菌絲體染色結果

本實驗采用蘇丹黑B染色法對第2、6、12天的黃孢原毛平革菌菌絲體進行染色。采用蘇丹黑B染色后，菌絲體中的脂肪粒呈現藍灰色，由此可以直觀地判斷菌絲體中脂肪含量的多寡。

在第2、6、12天，菌絲體內都存在藍灰色脂肪粒，并且呈現出先增加后減少的現象。第6天，脂肪粒的數量最多并且分布密集，菌絲體脂肪含量達到最高值。這與圖2中菌絲體內的脂肪含量呈現先增加后減少再趨于平穩的趨勢基本符合。

綜上所述，通過黃孢原毛平革菌菌絲體的鏡檢結果，可以說明在黃孢原毛平革菌的生長過程中有脂肪的合成，并且其變化趨勢與產脂培養實驗結果基本一致。通過生物量、菌絲體的變化，發現在培養過程中，生物量、菌絲體中脂肪含量都呈現先增加后減少再趨于平穩的趨勢。

5 結語

本實驗從定性方面來論述這一研究課題。運用蘇丹黑B染色法對第2、6、12天的黃孢原毛平革菌菌絲體進行染色，在光學顯微鏡下觀察到第2、6、12天的黃孢原毛平革菌菌絲體內均存在藍灰色的脂肪粒，并且脂肪粒的數量呈現出先增加后減少的趨勢，說明在黃孢原毛平革菌的生長過程中有脂肪的合成，其變化趨勢與產脂培養實驗中所得到的數據相符。

[1] GB/T 5009.6-2003.食品中脂肪的測定[S].北京:中國標準出版社,2003.

[2] 李元森.產油脂絲狀真菌的篩選及其產油脂條件的優化[D].山東輕工業學院碩士學位論文,2009.