聯合抗氧化劑對間歇低氧誘導小鼠胰腺損傷保護作用的研究*

李 光 李 昶 侯 剛 康 健△

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是臨床上常見的睡眠障礙性疾病，有證據表明OSA與胰島素抵抗（IR）和（或）2型糖尿病有關，且獨立于肥胖的程度[1]，亦有證據表明OSA可以通過多種生物機制導致IR和2型糖尿病，而氧化應激是其中最重的一種[2-3]。既然氧化應激被認為是OSA的病理生理機制之一，那么應用抗氧化劑應該可能對OSA患者有保護作用。為此，本研究選用間歇低氧（intermittent hypoxia，IH）動物模型來模擬OSA，探討聯合應用抗氧化劑氮氧化物4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶（4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-ox?yl，TEMPOL）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathi?one，GSH）對IH時氧化應激誘導胰腺損傷的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物與分組。50只體質量為（22±2）g，8～12周的雄性健康清潔級C57BL/6J小鼠，購自中國醫科大學實驗動物中心。用隨機數字表法將小鼠分為正常對照（CON）組、IH組、TEMPOL處理的IH（IH+TEMPOL）組、GSH處理的IH（IH+GSH）組，TEMPOL和GSH聯合處理的IH（IH+TEMPOL+GSH）組，每組各10只。（2）主要試劑與儀器。IH造模設備（Oxycycler Model A84XO，BioSpherix Instruments,Red?field,NY,USA），氧氣和氮氣（沈陽沈標氣體有限公司），血糖儀（OneTouch Ultra，LifeScan），諾和靈R（諾和諾德公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），缺口末端標記（TUNEL）法測定試劑盒（武漢博士德生物工程公司），TEMPOL,GSH（Sigma,St Louis，MO，USA）等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及給藥方法 各組小鼠均正常飲食水，保持12 h燈光12 h黑暗。CON組置于常壓培養箱中，空氣條件下飼養2周；IH組小鼠置于IH造模設備中，使氧氣濃度變化于21%～5%，持續4 min，而后氧氣濃度逐漸恢復至21%，持續4 min，每天持續8 h（8:00—16:00），共 2周。抗氧化劑TEMPOL溶于飲食中（濃度為1 mmol/L），GSH（10 mg/100 g體質量）每天于IH前30 min各腹腔注射1次。以上各組動物均于造模2周后實驗。

1.2.2 IR實驗 各組小鼠于實驗的最后8 h空腹，實驗結束后立即按0.75 U/kg劑量腹腔注射短效胰島素（諾和靈R），于注射前（0 min）和注射后15、30、60、90 min時剪尾尖采血，以血糖儀測定血糖水平。以0 min時血糖水平作為參比基礎，測定每一時間點的血糖比值。

1.2.3 氧化應激指標的檢測 采用硫代巴比妥酸（TAB）法測定胰腺組織MDA的水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性，并采用比色法測定胰腺組織谷胱甘肽轉移酶（GR）的水平[4]。

1.2.4 TUNEL染色檢測胰腺β細胞凋亡率 胰腺切片經20 mg/L蛋白酶K預處理15 min，用正常驢血清和BAS溶液阻滯，平衡后，于37℃時將TdT酶加入切片中1 h，加入終止溶液3,3＇,5,5＇-四甲基聯苯胺后，使用10 mmol/L PBS溶液沖洗切片，在室溫下滴加抗地高辛配基軛合物0.5 h。切片采用TUNEL+胰島素雙重染色：TUNEL染色β細胞核（綠色），胰島素染色細胞漿（紅色）。一個胰島TUNEL染色陽性β細胞的平均數（計數每組10只小鼠的20個胰腺切片上所有胰島TUNEL染色陽性β細胞數后，再除以胰島總數）×1 000后，比較5組小鼠胰腺β細胞凋亡率。凋亡率=單個TUNEL染色陽性β細胞數/單個胰島β細胞總數×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步組間多重比較采用LSD-t法，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠IR試驗的比較 30、60和90 min時，IH組在各時間點上血糖水平高于CON組（Plt;0.01），IH+TEMPOL+GSH組在上述相應時點血糖水平低于IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組（Plt;0.01），而IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組血糖水平差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表1。

Table 1 Comparison of the insulin resistance test at different time points between five groups表1 各組小鼠不同時點IR試驗的比較（n=10，%，x±s）

2.2 各組小鼠胰腺氧化應激指標的比較 IH組胰腺組織中MDA水平高于CON組，SOD和GR水平低于CON組（Plt;0.01）；IH+TEMPOL+GSH組MDA水平低于IH組，SOD及GR水平高于IH組（Plt;0.01）；IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組MDA、SOD和GR水平差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表2。

2.3 各組小鼠胰腺β細胞凋亡率的比較 IH組胰腺β細胞凋亡率高于CON組，IH+TEMPOL+GSH組胰腺β細胞凋亡率低于IH組、IH+TEMPOL組和IH+GSH組（Plt;0.01），IH+TEMPOL組、IH+GSH組與IH組胰腺β細胞凋亡率差異無統計學意義，見表2、圖1。

Table 2 Comparison of oxidative stress indicators and the pancreatic β-cell apoptosis between five groups表2 各組小鼠胰腺氧化應激指標及β細胞凋亡率的比較（n=10，x±s）

3 討論

3.1 OSA（或IH）并發IR和（或）2型糖尿病的機制 OSA（或IH）是IR和（或）2型糖尿病一種新的危險因素，其發生糖代謝異常可能有多種病理生理機制，氧化應激的增加是其中的重要機制之一，OSA患者的胰腺損傷與IH誘導的氧化應激有關，并且依賴于活性氧（reactive oxygen species，ROS）的毒性作用。

3.2 抗氧化劑TEMPOL和GSH的抗氧化作用及其機制 研究表明抗氧化劑TEMPOL（SOD模擬劑）通過減輕氧化應激可有效阻止IH大鼠活性氧自由基誘導的持續血壓增高[5]，亦可減輕骨骼肌微血管對去甲腎上腺素能的血管收縮反應和肌源性活動[6]。GSH是細胞內主要的抗氧化物之一，通過非酶反應及連接谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）可以減輕自由基損傷作用，在多種組織和動物模型中GPx的缺乏可產生許多有害作用。GSH可有效阻止IH時舒張壓升高，其舒張壓的增高是由于氧化應激造成的，也可部分阻止脂質誘導的整體IR。有研究報道聯合應用抗氧化劑TEMPOL和GSH可抑制C57BL/6J小鼠由于靜脈輸入脂肪乳誘導的整體和骨骼肌IR，幾乎完全逆轉了氧化應激，而單獨應用TEMPOL或GSH則無明顯作用[7]。

3.3 抗氧化劑TEMPOL和GSH對OSA（或IH）的意義 本研究證實TEMPOL和GSH的聯合應用可減輕IH時氧化應激反應，從而減輕胰腺β細胞凋亡及IR，而單獨應用其中任何一種未能有效地減輕氧化應激，逆轉IH誘導的胰腺損傷。其機制為SOD和GPx是ROS的關鍵清除劑，即TEMPOL清除O2-，GSH鈍化H2O2。該研究提示氧化應激是IH胰腺損傷的主要原因，因此，氧化應激的調節可以對IH時氧化應激誘導的胰腺損傷提供有效地保護治療，為OSA患者的藥物治療提供新的契機。

Figure 1 Comparison of apoptotic rates of pancreatic β-cells between five groups（TUNEL,×200）圖1 各組小鼠胰腺β細胞凋亡率的比較（TUNEL染色,×200）

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