ING4和CDX2在結直腸癌中的表達及其與預后的關系

劉俊遠 黃桂林 李志剛 叢竹軍 孫旭凌 祝 磊

結直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內其發病率居所有惡性腫瘤第三位[1]。在我國，結直腸癌的發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[2]，對患者的生活質量造成了嚴重的影響。生長抑制因子 4（inhibitor of growth family member 4，ING4）及尾型同源盒轉錄因子2（caudal type home?obox transcription factor 2，CDX2）是近年來新發現的候選抑癌基因，在腫瘤的增殖、轉移過程中發揮重要作用。本研究通過免疫組織化學法檢測ING4和CDX2在結直腸癌組織中的表達，初步探討其在結直腸癌的發生、發展及預后判斷方面的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2007年1月—2008年4月我院經病理確診為原發結直腸癌患者的石蠟標本共99例，其中男51例，女48例，年齡30～85歲，平均（62.92±11.84）歲。其中結腸癌36例，直腸癌63例；高分化9例，中分化75例，低分化15例；無淋巴結轉移57例，有淋巴結轉移42例；T1期6例，T2期25例，T3期52例，T4期16例；Ⅰ期26例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期8例。所有患者均行結直腸癌根治術治療，術前均未接受放射線治療和化療，臨床及病理資料完整。術后采用電話及信訪方式進行隨訪，起點為確診之日，終點為患者出現死亡、失訪或至截止時間（2013年5月30日），隨訪結束時，獲得完整隨訪資料87例，隨訪率為87.8%，35例結直腸癌患者死亡。同時選擇30例距腫瘤大于5 cm的遠端正常組織作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人ING4多克隆抗體（ab113425）購自美國abcam公司，兔抗人CDX2單克隆抗體、Envision試劑盒及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學 石蠟包埋的結直腸癌標本行4 μm厚連續切片，染色步驟嚴格按Envision試劑盒的操作說明進行，ING4、CDX2抗體均按1∶200稀釋，以PBS液代替一抗做陰性對照。

1.2.3 結果判定 由2名高年資病理科醫師在雙盲情祝下進行染色評分。ING4陽性表達以細胞核和或胞漿內出現棕黃色顆粒為準；CDX2以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性。使用半定量的評分系統來評估抗體的染色效果，計數5個高倍視野或500個細胞。按染色強度計分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細胞所占百分比計分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為陽性細胞數11%～50%，3分為陽性細胞數51%～75%，4分為陽性細胞數gt;75%，染色強度與陽性細胞所占百分比計分乘積為染色評分，＜6分為陰性，≥6分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行處理，計數資料比較用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關，Kaplan-Meier乘積極限法計算累積生存率并繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗比較生存率，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ING4、CDX2在結直腸癌組和對照組中的表達 結直腸癌組ING4表達陽性率為68.8%（68/99），低于對照組的93.3%（28/30），結直腸癌組CDX2表達陽性率為72.7%（72/99），低于對照組的96.7%（29/30），差異均有統計學意義（χ2分別為7.346、7.764，均Plt;0.05），見圖1。

2.2 ING4、CDX2的表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 不同浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移及腫瘤分期結直腸癌患者組織中ING4和CDX2的表達差異有統計學意義，而不同年齡、性別、腫瘤大小及部位結直腸癌患者組織中ING4和CDX2的表達差異無統計學意義，見表1。

Figure 1 The positive expressions of ING4 andCDX2 in colorectal cancer（immunohistochemistry,×400）圖1 結直腸癌組織中ING4、CDX2的陽性表達（免疫組化,×400）

Table 1 Relationships between expressions of ING4 and CDX2 and clinicopathological factors of colorectal cancer表1 ING4、CDX2表達與結直腸癌臨床病理特征的關系例（%）

2.3 結直腸癌組織中ING4、CDX2表達的相關關系 結直腸癌組織中的ING4與CDX2表達呈正相關（rs=0.418，Plt;0.01）,見表2。

Table 2 The correlation between ING4 and CDX2 expressions in colorectal cancer表2 結直腸癌組織中ING4、CDX2表達的相關性

2.4 結直腸癌組織中ING4、CDX2的表達與預后的關系 ING4陰性者5年生存率為35.5%，低于ING4陽性者的77.9%，差異有統計學意義（Log-rankχ2=16.721，Plt;0.01）；CDX2陰性者的 5年生存率為48.1%，低于CDX2陽性者的70.8%，差異有統計學意義（Log-rankχ2=5.404，Plt;0.05），見圖2、3。

Figure 2 The survival curves of ING4 positive group and ING4 negative group in patients with colorectal cancer圖2 結直腸癌患者ING4陽性組與陰性組的生存曲線

Figure 3 The survival curves of CDX2 positive group and CDX2 negative group in patients with colorectal cancer圖3 結直腸癌患者CDX2陽性組與陰性組的生存曲線

3 討論

ING4屬于生長抑制因子家族，該家族與細胞周期調控、細胞凋亡、DNA損傷修補及血管生成密切相關[3]。ING4廣泛參與腫瘤發生、發展的多個過程，Shiseki等[4]研究發現，ING4可通過上調p53的轉錄活性，打亂正常的細胞周期進程，使細胞生長停滯，促進細胞凋亡。Shi等[5]發現：ING4可以與核因子（NF）-κB結合，引起白介素（IL）-8表達水平下降，導致腫瘤血管生成減少。Kim[6]研究發現，ING4可抑制因原癌基因MYC或MYCN過度表達引起的細胞間接觸抑制的丟失，此外，ING4能夠抑制乳腺癌細胞在軟瓊脂中的非貼壁性生長，這兩者在體外研究中均被認為是正常細胞惡性轉化的重要標志。低氧誘導因子（HIF）是組織細胞為適應缺氧環境所產生的關鍵因子，Ozer等[7]研究發現ING4與HIF-1α的表達水平呈負相關，提示ING4可以抑制細胞對缺氧環境的適應，抑制腫瘤細胞的生長。ING4還可以增加腫瘤細胞對化療的敏感性，Klironomos等[8]用細胞毒藥物阿霉素和鬼臼乙叉甙處理外源性ING4基因感染的HepG2細胞，結果顯示ING4能提高HepG2細胞對阿霉素、鬼臼乙叉甙的化療敏感性。ING4在正常組織中表達豐富，但在多種惡性腫瘤組織中表達明顯下調，有研究顯示其在胃癌組織中的陽性表達率為54.5%[9]，在結直腸癌中的陽性表達率為63.3%[10]。本研究結直腸癌組織中ING4陽性表達率為68.8%，低于遠端正常組織，與文獻報道一致，提示ING4低表達與結直腸癌的發生、發展密切相關。本研究結果表明ING4與腫瘤的惡性程度關系密切，并參與了腫瘤的浸潤和轉移；此外，ING4陰性表達組的5年生存率明顯低于陽性表達組，提示ING4表達缺失的結直腸癌患者預后不良。

CDX2是一種特異性核轉錄因子，在鑒別腸源性腫瘤方面有重要價值。近年來CDX2的抑癌作用也越來越受到人們關注，研究表明CDX2能抑制結直腸癌細胞的轉移,降低腫瘤的惡性程度，Gross等[11]通過RNA干擾技術阻止結腸癌細胞中CDX2的表達，發現下調CDX2的表達可使腫瘤細胞轉移能力增強。任海亮等[12]將含CDX2的真核表達載體轉染至結腸癌LoVo細胞株，然后將穩定轉染CDX2的單克隆LoVo細胞株植于裸鼠皮下，發現CDX2在Lo?Vo細胞中的過表達能夠抑制移植瘤的生長。Zheng等[13]通過檢測結直腸癌組織及結腸癌細胞系（SW480和LS174T）中CDX2的表達，發現CDX2在結直腸癌中的表達明顯低于正常結直腸組織，而且隨著結直腸癌分化程度降低，CDX2蛋白的表達明顯減少，有淋巴結轉移組CDX2蛋白的表達明顯少于無淋巴結轉移組，CDX2在結直腸癌DukesA期到D期的表達依次減少。本研究CDX2蛋白在結直腸癌中的陽性表達率為72.7%,低于癌旁正常結直腸組織，與國內外報道結論一致；且CDX2表達水平和組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分期關系密切，CDX2陰性表達組的5年生存率明顯低于陽性表達組，提示CDX2表達減少，腫瘤的惡性程度增高，易發生浸潤轉移，患者的預后差。

腫瘤的發生發展是一種多步驟、多階段復雜的過程，其中包括多種因子的相互作用。有研究發現，ING4基因與NF-κB的結合，除了影響IL-8的表達，還可以抑制NF-κB調節基因環氧化酶（COX）-2的轉錄[14]，COX-2在腫瘤血管生成及腫瘤細胞轉移等多個過程中發揮了重要作用。而Mutoh等[15]在體外人結腸腺癌細胞系的研究中發現CDX-2有類似功能，CDX2可以通過阻礙NF-κB-DNA復合物的形成抑制COX-2 mRNA及其蛋白轉錄水平的表達，提示ING4和CDX-2在腫瘤的發生、發展過程中相互作用，但具體機制還有待進一步研究。本研究發現，結直腸癌組織中ING4和CDX2蛋白的表達呈正相關，且均與預后有關，提示兩者可能在結直腸癌發生、發展過程中相互影響、共同促進，兩者聯合檢測可作為評價結直腸癌惡性程度和判斷預后的重要指標。

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