宮頸病變中hTERT基因擴增與高危型HPV感染的關系*

李洪林 尹利榮 孫俊杰

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率在 女性惡性腫瘤中居第二位，且近年來發病呈年輕化趨勢，是嚴重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤。宮頸癌是由癌前病變，即宮頸上皮內瘤變（cervicalin?traepithelial neoplasia，CIN）逐步發展形成。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續性感染是導致CIN及宮頸癌的主要原因，中國人群中高危型HPV（HR-HPV）感染在CIN及宮頸癌發病中的作用已基本得到公認。人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）是人端粒酶復合物的核心成分之一，其基因表達狀態是細胞調控端粒酶活性的主要環節，hTERT在細胞永生化中起重要作用。但目前關于hTERT基因在宮頸病變中擴增情況的研究較少，而且宮頸病變中hTERT基因擴增與HR-HPV感染的相關性報道更少，本實驗應用熒光原位雜交技術（fluorescent in si?tu hybridization，FISH）檢測hTERT基因在CIN及宮頸癌中的擴增情況，研究宮頸病變中hTERT基因擴增與HR-HPV感染的相關性，為CIN的早期篩查、診斷、預測病變提供依據。

1 資料與方法

1.1 標本來源 連續入選2012年9月—2013年4月于我院婦科就診的CIN及宮頸癌患者118例（實驗組），其中CINⅠ級31例，CINⅡ級33例，CINⅢ級34例，宮頸癌20例；取其宮頸脫落細胞標本。選取34例正常的宮頸脫落細胞標本為對照組，均無先天性遺傳病、嚴重內科疾病及其他部位腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA檢測 所有研究對象均行聚合酶鏈反應（PCR）-反向雜交芯片法檢測HPV DNA分型，試劑盒購自港龍生物技術（深圳）有限公司。

1.2.2 FISH檢測hTERT基因擴增情況 （1）探針來源。hTERT探針購于KREATECH公司，為hTERT/CDC25C/EGR1 DNA探針。hTERT DNA探針雜交到5號染色體5p 15.3，熒光信號為紅色（PlatinumBright 550）,CDC25C/EGR1 DNA(對照探針)雜交到5號染色體5q 31.2，熒光信號為綠色(Platinum?Bright 495),呈雙色探針。（2）FISH操作。用薄層液基細胞學宮頸刷采集宮頸脫落細胞固定于載玻片上制片，于室溫放置過夜。玻片置于37 ℃ 2×SSC（pH7.0）液中漂洗2 min；在0.01 mol/L HCl配置成的0.005%胃蛋白酶溶液中溫育15 min（37℃）；1×PBS液中漂洗3 min（室溫）；1×PBS液配置成的1%甲醛溶液中固定10 min（室溫）；再次1×PBS液中漂洗3 min（室溫）；分別于70%、85%和100%乙醇梯度脫水固定，室溫下自然干燥玻片。避光環境下每22 mm×22 mm雜交區域滴加10 μL探針混合，加蓋玻片，橡皮膠封邊，于75℃共變性10 min，37℃保溫箱過夜雜交。第2天移去蓋玻片，立即將玻片置于0.4×SSC溶液中，溫度（72±1）℃ 2 min；再置于2×SSC溶液中漂洗1 min（室溫）；最后分別于70%、85%和100%乙醇梯度脫水1 min固定，室溫下暗處自然干燥玻片，加15 μL DAPI復染劑，加蓋玻片，暗處放置20～30 min。（3）結果分析。FISH信號判斷應用OLYMPUS B×51型熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/Texas Red三色濾光鏡激發下，觀察間期細胞熒光雜交信號，用Video－Test公司提供的FISH分析軟件進行圖像分析。正常細胞單個間期細胞核中紅色及綠色信號各為2

1.3 統計學方法 所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，各組總體均數比較用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，多組比較檢驗水準α=0.05，進一步兩兩比較時檢驗水準α=0.005。個。hTERT基因擴增異常細胞單個間期細胞核中紅色信號大于3個，綠色信號2個。每例分析200個間期細胞核，對各通道下均顯示清晰可辨的、孤立的、雜交信號明顯的細胞核進行計數，并計算其所占百分比。對重疊、破損、輪廓不清的不計數，微弱雜交信號者不計數。細胞內雜交信號互相靠近者計為1個信號。閾值建立:采集20例正常人宮頸脫落細胞，使用上述方法進行FISH實驗，每例分析至少200個細胞，統計出異常hTERT信號細胞數目的百分比。異常閾值=均數+3×標準差。本研究中異常閾值為0。結果判斷：根據閾值判斷結果。每例樣本任意計數200個細胞，如果異常細胞≥1，判定為陽性結果；如果異常細胞數為0，判定為陰性結果；對于不明確的異常細胞，則加大觀測樣本細胞數目，以判斷最后結果。

2 結果

2.1 5組年齡比較 宮頸癌組的年齡大于對照組、CIN Ⅰ級、CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級組（Plt;0.05），其他4組年齡差異無統計學意義，見表1。

Table 1 Comparison of average age,HR-HPV infection and hTERT amplification between five groups表1 各組年齡、HR-HPV感染及hTERT基因擴增情況比較

2.2 5組HR-HPV DNA陽性率比較 共檢出20種HR-HPV：HPV16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，67，68，69，73，82。CIN Ⅱ級、CINⅢ級、宮頸癌組的HR-HPV DNA陽性比例高于對照組(Plt;0.005)，正常組與CINⅠ級組比較差異無統計學意義，見表1。

2.3 5組hTERT基因擴增陽性率比較 實驗組與對照組宮頸脫落細胞標本hTERT/CDC25C/EGR1 DNA探針雜交后，均可清晰看到紅色及綠色的探針雜交信號亮點,見圖1、2。宮頸癌組的hTERT基因擴增陽性率高于正常組、CINⅠ級、CINⅡ級組（Plt;0.005）。宮頸癌與CINⅢ級組比較差異無統計學意義（Pgt;0.005），見表1。hTERT基因擴增陽性與HR-HPV感染陽性之間呈正相關(r=0.238，Plt;0.05)，見表2。

Figure 1 The exfoliated cervical nucleus without abnormal hTERT amplification（×1 000）圖1 hTERT基因無異常擴增的宮頸脫落細胞核（×1 000）

Figure 2 The exfoliated cervical nucleus with abnormal hTERT amplification（×1 000）圖2 hTERT基因異常擴增的宮頸脫落細胞核（×1 000）

Table 2 Correlation analysis between hTERT amplification and HR-HPV infection表2hTERT基因擴增與HR-HPV感染的相關性分析

3 討論

3.1 HR-HPV感染與宮頸病變關系 已有較多研究得出結論HR-HPV感染是引起宮頸癌的重要誘因之一[1]，本研究結果提示，隨著宮頸病變級別的升高，HR-HPV DNA陽性率逐漸增高，對照組分別與CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌組比較，各組間差異有統計學意義，而對照組與CINⅠ級相比無明顯差異，說明HR-HPV感染在大多數婦女中是暫時的，HPV感染是可逆的，只有持續的感染，最終HPV DNA整合入宿主染色體導致宿主細胞惡性轉化，CINⅠ級作為低級別上皮內瘤變，屬于可逆性病變，可能是HRHPV感染后的早期時間，與宿主的惡性轉化無關。

3.2 hTERT基因與宮頸病變的關系 人端粒酶是由hTERT、端粒mRNA（hTERC）及端粒酶結合蛋白(hTP1)組成。端粒酶的意義是通過端粒的作用來實現的，端粒是真核細胞染色體的末端物質，有分裂鐘之稱，端粒DNA序列高度保守，在維持染色體穩定性中起重要作用。研究證實端粒酶基因的激活出現在85%～90%的癌細胞中，其作用是保持端粒的長度和結構，使癌變細胞永生化[2]。hTERT是端粒酶的限速酶，它屬于逆轉錄酶家族的成員，其編碼基因位于染色體5p上，能以hTERC為模板合成端粒序列以穩定端粒長度使細胞獲得永生。hTERT基因主要表達于癌細胞中，正常細胞不表達或僅有少量表達。Oikonomou等[3]研究表明，端粒酶的激活可能是宮頸癌發生的早期事件。Anedchenko等[4]對宮頸癌細胞和組織的檢測發現，hTERT基因的表達與端粒酶的活性密切相關。本實驗結果顯示hTERT基因擴增陽性率隨著宮頸病變嚴重程度的加重而逐漸增高，對照組中hTERT基因無異常擴增，早期宮頸病變中hTERT基因擴增的陽性率較低，宮頸癌組hTERT基因擴增的陽性率明顯高于對照組、CINⅠ級、CINⅡ級，而宮頸癌組與CINⅢ級無明顯差異，表明CINⅠ/Ⅱ級屬于低危性病變，當宮頸病變發展到CINⅢ級和宮頸癌時，hTERT基因異常擴增的細胞數增多并且基因拷貝數增加，從而使端粒酶活性增強，使染色體端粒維持在一定長度而獲得永生和無限增值，進而提示hTERT基因擴增與早期宮頸病變及其進展有關。因此，應用FISH技術檢測hTERT基因擴增情況不僅可作為宮頸癌前病變的臨床醫學檢測的輔助指標，而且可以用來預測低危性病變CINⅠ/Ⅱ是否進展。

3.3 HR-HPV感染與hTERT基因在宮頸病變中的關系 因為僅少數HPV感染者最終發展為宮頸癌，所以HPV感染不是細胞惡性轉化的唯一致病因素[5]，還有其他致病因素共同導致宮頸癌的發生，本研究評估在宮頸病變進展過程中，hTERT基因擴增與HR-HPV感染的相關性，結果表明HR-HPV陽性率高于hTERT基因擴增的陽性率，而hTERT基因擴增陽性的宮頸病變中，大多數是HR-HPV感染，因此推測HPV感染早于hTERT基因的擴增，兩者在病變發展過程中有時序性差異，即繼發于HR-HPV感染的宮頸病變仍需hTERT基因的異常擴增，兩者協同導致宮頸病變的加重。但是HR-HPV感染并不都伴有hTERT基因的擴增，hTERT基因的擴增并不均伴有HR-HPV的感染，兩者也存在一定的獨立性，也就是說，HR-HPV感染具有可逆性，多發生在癌前病變早期，而HR-HPV DNA整合是不可逆的，病毒整合和hTERT基因擴增多發生在癌前病變中晚期，HR-HPV整合到宿主基因組，從而導致hTERT基因異常擴增，或者HR-HPV整合伴隨染色體不穩定的發生，最終導致細胞的惡性轉化，其機制需進一步研究。有學者發現端粒酶的激活是HR-HPV感染宮頸組織后由CIN向宮頸癌轉化過程中相當關鍵的步驟[6]。Baege等[7]用HPV E6/E7轉染宮頸上皮細胞，發現轉染晚期（第30天）比轉染早期（第4天）的hTERT基因水平升高25倍，說明HPV感染影響hTERT的表達。Theelen等[8]認為，HPV16/18 DNA整合到宮頸上皮細胞，使hTERT基因異常擴增。Van Doorslaer等[9]研究發現，HPV 16E6蛋白激活端粒酶hTERT基因的啟動子，使其表達增強活性增高。關于宮頸病變中hTERT mRNA、蛋白與HR-HPV感染的關系仍需進一步探討。

[1]Guo M，Gong Y，Wang J，et al.The role of human papillomavirus type 16/18 genotyping in predicting high-grade cervical/vaginal in?traepithelial neoplasm in women with mildly abnormal Papanico?laou results[J].Cancer Cytopathol，2013，121（2）：79-85.

[2]Axelrad MD，Budagov T，Atzmon G.Telomere length and telomer?ase activity;a yin and yang of cell senescence[J].J Vis Exp，2013，(75)：e50246.

[3]Oikonomou P，Mademtzis I，Messinis I，et al.Quantitative determi?nation of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA expression in premalignant cervical lesions and correlation with hu?man papillomavirus load[J].Hum Pathol，2006，37(2)：135-142.

[4]Anedchenko E，Oparina N,Dmitriev A，et al.Activation of the hTERT expression in squamous cell cervical carcinoma is not associated with gene amplification[J].Oncol Rep，2008，20(2)：469-474.

[5]Jab?onowska D，Marsza?ek A，Bodnar M，et al.HPV infection and changes in cervix[J].Przegl Lek，2012，69(10)：740-743.

[6]Theelen W，Speel EJ，Herfs M，et al.Increase in viral load,viral inte?gration,and gain of telomerase genes during uterine cervical carci?nogenesis can be simultaneously assessed by the HPV 16/18 ML?PA-assay[J].Am J Pathol，2010，177(4)：2022-2033.

[7]Baege AC，Berger A，Schlegel R，et al.Cervical epithelial cells transduced with the papillomavirus E6/E7 oncogenes maintain sta?ble levels of oncoprotein expression but exhibit progressive,major increases in hTERT gene expression and telomerase activity[J].Am J Pathol，2002，160(4)：1251-1257.

[8]Theelen W，Reijans M，Simons G，et al.A new multiparameter as?say to assess HPV 16/18,viral load and physical status together with gain of telomerase genes in HPV-related cancers[J].Int J Can?cer，2010，126(4)：959-975.

[9]Van Doorslaer K，Burk RD.Association between hTERT activation by HPV E6 proteins and oncogenic risk[J].Virology，2012，433(1):216-219.