RIP3基因重組質粒構建及其表達對MCF7細胞死亡方式的影響*

路 燦 徐惠君 賈勇圣 佟仲生

受體相互作用蛋白3（receptor-interacting pro? tein 3，RIP3）是受體相互作用蛋白家族的一員，是腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介導的細胞凋亡和細胞壞死之間的分子開關，在凋亡受到抑制時，RIP3可以通過調節能量代謝而介導細胞壞死[1]。它廣泛表達于胚胎和大量成熟組織中，但在一些腫瘤細胞中低表達，如宮頸癌細胞HeLa，骨肉瘤細胞U2OS等[2]。本研究擬構建RIP3基因的真核表達載體，建立穩定過表達RIP3基因的MCF7細胞系，并證實其融合蛋白在細胞內的表達、定位及介導壞死的功能，為進一步探討程序性壞死的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Phusion Hot StartⅡDNA polymerase、Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；限制性內切酶NheⅠ、NotⅠ購自Fermentas公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，In-fusion連接酶，E.coliDH5α菌株，質粒提取試劑盒均購自Takara公司；Dulbecco’s Modi fi ed Eagle’s Medium（DMEM）培養液購自neuron-biotech公司；胎牛血清（FBS）購自蘭州民海生物工程有限公司；青鏈霉素（PS）混合液購自北京Solarbio Science and Technology公司；0.25%胰酶購自天津百若克醫藥生物技術有限公司；聚凝胺、殺稻瘟菌素均購自Santa Cruz公司，RIP3鼠兔源單克隆抗體購自天津三箭生物技術有限公司。pCDH-CMV-MCS-EF1-blastici?din-mCherry載體為本實驗室已有資源，經轉化E.coliDH5α菌株擴增后，用DNA/RNA定量儀測定DNA濃度，置-20℃冰箱保存。

1.2 細胞培養 MCF7、MDA-MB-231、T47D、MDA-MB-435、MCF10A、293T細胞系為本實驗室保存。MCF10A細胞用DMEM/F12培養基（含5%馬血清、100 μg/L霍亂毒素、10 mg/L胰島素、20 μg/L表皮生長因子、1.4×106mol/L氫化可的松、1%青鏈霉素），其余細胞用DMEM培養基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素）在37℃5%CO2培養箱中培養。

1.3 RT-PCR檢測乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞中RIP3 mRNA的表達 分別收集乳腺癌細胞株MCF7、MDA-MB-231、T47D、MDA-MB-435及正常乳腺上皮細胞MCF 10A各約1×106個，按Trizol和反轉錄酶試劑說明書分別提取RNA，用分光光度計測定濃度之后，用逆轉錄試劑盒得到cDNA，以GAPDH作為內參照，進行PCR擴增。引物序列：RIP3上游5＇-GAGTTGCCAACCGAACCATCACT-3＇，下游5＇-TACCGTG?GAGACAGCATTCA-3＇。PCR反應體系20 μL，反應條件：預變性95℃3 min，變性95℃10 s，退火65.5℃30 s，延伸72℃30 s，共35個循環，72℃5 min后，溫度降至4℃。擴增長度為243 bp。反應產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳，UVP掃描并分析結果。

1.4 RIP3全長編碼序列PCR擴增 以逆轉錄得到的MCF10A cDNA為模板進行RIP3基因cDNA全長的PCR擴增，上游引物：5＇-TGTACAAGTCTAGAGCTAGCATGTCGTGC?GTCAAGTTA-3＇，下游引物：5＇-CGCGGCCGCGGATCCT?TATTTCCCGCTATGATT-3＇，包含NheⅠ、NotⅠ酶切位點。PCR反應體系為50 μL，含模板50 ng，10×Phusion緩沖液5 μL，dNTPs每種200 μmol/L，引物0.5 μmol/L和Phusion DNA聚合酶0.5 μL。PCR反應條件為：預變性98℃30 s，變性98 ℃ 10 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，20個循環，72 ℃10 min后，溫度降至4℃。擴增長度為1 587 bp。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒回收擴增片段。

1.5 mCherry-RIP3表達載體的構建 將上述擴增回收產物即目的基因與事先用NheⅠ、NotⅠ酶切的pCDH-mCherry載體連接，反應體系：載體1 μL，PCR回收產物3 μL，In-fusion連接酶2.5～3 μL，加入H2O共15 μL，室溫連接30 min后，將連接反應混合物轉化E.coliDH5α，經氨芐霉素篩選，挑取單個克隆培養后,取菌液用小提試劑盒提取質粒，NheⅠ、NotⅠ酶切鑒定。鑒定產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像分析儀上成像。鑒定正確的重組載體送基因公司測序，經測序比對正確后，再大量擴增。

1.6 包被慢病毒建立穩定表達mCherry-RIP3的MCF7細胞株 轉染前1 d鋪種293T細胞于6 cm細胞培養皿中，使細胞匯合度達到50%。取20 μg構建的mCherry-RIP3表達載體，兩種包裝載體各10 μg，鈣法轉染293T細胞。同時轉染不含目的基因的熒光載體作為對照。培養48 h后離心收集上清，-80℃貯存。感染前1 d鋪種MCF7細胞于6孔板中，每孔2×105個細胞。感染時，棄去細胞培養液，加入600 μL病毒液及1 μL的聚凝胺，繼續培養48 h后，觀察熒光，重懸細胞并加入4 mg/L的殺稻瘟菌素藥篩，維持藥物濃度1周，分別可得到穩定表達RIP3的細胞株及空白熒光載體的細胞株。

1.7 Western Blot 將MCF7細胞、構建的表達mCherry-RIP3及空載體的MCF7細胞鋪種于6孔板中，培養至匯合度為60%～80%后，每孔加入200 μL細胞裂解液（Lysis Buffer）裂解MCF7細胞，收集蛋白。各樣品取30 μg蛋白上樣電泳，轉硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）過夜。第2天將NC膜轉移至封閉液（5%脫脂奶粉）中，搖床封閉1 h，孵育Anti-RIP3兔源的單克隆一抗1 h，TBS-T沖洗，孵育熒光標記的二抗1 h，TBS-T沖洗，紅外雙色熒光掃描成像儀，觀察結果。

1.8 TNF-α及Caspase抑制劑Z-VAD-FMK處理下MCF7的死亡情況 將表達mCherry-RIP3及空載體的MCF7細胞(細胞數3×105個/孔)分別鋪于6孔細胞培養板（每種細胞各3個孔）過夜，分別給予 0 mg/L、50 mg/L TNF-α及20 μmol/L Z-VAD-FMK預處理30 min，再加入TNF-α至終濃度50 mg/L處理12 h后，顯微鏡下觀察細胞形態，每種處理隨機取3個視野計算細胞死亡數及細胞總數。之后在細胞培養液中加入Hoechst 33342染料染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態。

1.9 統計學方法 實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據以±s表示，各組間比較采用t檢驗，每組內不同處理方式比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞系RIP3 mRNA的表達 RIP3 mRNA在MCF10A中表達較高，而在4種乳腺癌細胞系中普遍低表達，其中MDA-MB-435和MDA-MB-231細胞相對較高，T47D和MCF7細胞的表達量相對較低，見圖1。本實驗選擇MCF7細胞用于轉染RIP3重組質粒的研究。

Figure 1 Different mRNA levels of RIP3 in 4 kinds of breast cancer cells and 1 kind of mammary epithelial cell MCF10A圖1 RIP3 mRNA在4種不同乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞MCF10A內的表達

2.2 RIP3基因全長的PCR擴增及載體的酶切 以cDNA為模板，PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增產物約1 587 bp，與預期大小一致。同時用限制性內切酶NheⅠ、NotⅠ酶切pCDH-mCherry載體，見圖2。

Figure 2 PCR amplification product of RIP3 cDNA and restriction enzyme digestion of the recombinant plasmid mCherry-RIP3圖2 RIP3基因全長的PCR擴增產物及重組載體的雙酶切鑒定

2.3 RIP3重組載體的鑒定及其序列的測定 將RIP3重組載體用NheⅠ、NotⅠ酶切，可見切出大小約1 560 bp的條帶，見圖2。測序結果經Pubmed Blast比對后證實插入pCDH-mCherry載體的目的基因正確無誤。

2.4 mCherry-RIP3融合蛋白在MCF7細胞中的表達 將mCherry-RIP3基因通過慢病毒導入MCF7細胞中，經Western blot檢測到了mCherry-RIP3融合蛋白的表達，分子質量約為85 ku，見圖3A。

2.5 mCherry-RIP3融合蛋白在細胞中的定位 通過熒光顯微鏡觀察到表達mCherry-RIP3的MCF7只有細胞質中可見紅色熒光分布，見圖3B。

2.6 mCherry-RIP3融合蛋白在MCF7細胞中介導TNF-α誘導的程序性壞死 表達mCherry-RIP3及空載體的MCF7細胞經TNF-α處理均有約50%的細胞表現出凋亡的形態特征：細胞縮小變圓，胞膜清晰完整，核固縮。而Z-VAD-FMK預處理后再用TNF-α處理，轉入空載體的MCF7細胞的凋亡被抑制，而表達mCherry-RIP3的MCF7細胞死亡數目增加且表現出明顯的壞死樣形態特征：形態不規則，胞膜模糊，核碎裂溶解，見圖4。不同處理方法的空載體-MCF7細胞和RIP3-MCF7細胞的存活率均不相同，差異有統計學意義（均P＜0.01）。未處理及TNF-α處理下的空載體-MCF7與RIP3-MCF7細胞的存活率差異無統計學意義，而在TNF-α聯合Z-VADFMK處理下，RIP3-MCF7細胞的存活率明顯低于空載體-MCF7的細胞存活率（P＜0.01），見表1。

Table 1 The cell survival rate of RIP3/Vector-MCF7 under the treatment of TNF-α and Z-VAD-FMK表1 TNF-α及Z-VAD-FMK處理下RIP3/空載體-MCF7細胞的存活率 （n=3，%）

3 討論

近年來，程序性壞死成為繼凋亡之后細胞死亡方式的又一研究熱點。傳統理論認為，壞死是一種細胞在受到一些物理因素、化學因素或生物因素等環境因素的傷害時出現的大量急速死亡，是一種被動的死亡[3]。后來人們發現TNF-α不但能誘導多種細胞的凋亡，而且還能誘導小鼠成纖維細胞L929的壞死[4]，并且Caspase抑制劑Z-VAD-FMK能加強TNF-α誘導的L929細胞壞死[5]。這表明這種細胞壞死可以由特定因子啟動,按照一定通路和程序發生，并且是可控的，因而稱為程序性壞死[6]。韓家淮教授課題組研究發現，在低表達RIP3的NIH3T3細胞中，TNF-α誘導的凋亡可以被caspase的廣泛抑制劑ZVAD-FMK.fmk所抑制；而在高表達RIP3的NIH3T3細胞,Z-VAD-FMK.fmk卻可以增強TNF-α誘導的死亡，并且死亡呈現壞死的形態，進而證明了RIP3是TNF-α誘導的細胞凋亡和壞死相互轉換的分子開關[7]。異位表達RIP3使得對TNF-α誘導性細胞壞死有抗性的細胞轉變成敏感型細胞[2]。Sakon等[8]證明TNF-α誘導產生的活性氧簇（ROS）積聚介導了小鼠胚胎成纖維（MEF）細胞的壞死性死亡。對其具體的執行機制研究表明，RIP3活化后,通過激活糖原磷酸化酶（glycogen phosphory lase，PYGL）、谷氨酸氨基連接酶（glutamate amino ligase，GLUL）和谷氨酸脫氫酶1（glutamate dehydrogenase 1，GLUD1）產生ROS積聚導致細胞壞死[9]。

更深入的研究RIP3基因的功能及其下游的相互作用因子將有助于人們發現新的治療靶點?；蚬δ艿难芯啃杞柚D基因技術，本實驗通過從cDNA中PCR擴增出RIP3基因全長，連接至含有紅色熒光蛋白mCherry的真核表達慢病毒載體中，聯合利用酶切鑒定以及基因測序分析的方法，證實了mCher?ry-RIP3重組質粒構建成功。用慢病毒感染本身低表達RIP3的MCF7細胞，構建穩定細胞株；用West?ern技術證明其高效表達mCherry-RIP3；在熒光顯微鏡下觀察其轉染效率及融合蛋白的細胞定位[10]，并通過TNF-α和Z-VAD-FMK的處理證明了其在MCF7細胞中介導壞死的作用。

程序性壞死參與多種疾病的發生發展，如腦缺血和糖尿病等代謝疾病，神經退行性疾病,腫瘤等[11-12]。程序性壞死在腫瘤細胞中作為一種凋亡的替代死亡方式，其功能缺陷或相關基因突變可能參與某些腫瘤的發生發展[13]。有研究表明程序性壞死不但可以加速腫瘤細胞的死亡還可能增加腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性[14-15]。本研究通過構建mCherry-RIP3融合蛋白真核表達載體，建立穩定高表達RIP3的細胞系，可以實時觀察RIP3的功能定位及其對細胞在不同刺激下凋亡、壞死等死亡機制的影響，以及RIP3調節的下游靶基因的啟動子、mRNA及蛋白水平的表達，便于進一步研究其在程序性壞死信號轉導中所擔當的角色，從而更有效地調控細胞的死亡。為缺血再灌注損傷，神經退行性變，腫瘤的治療提供新的靶點[16-17]。

Figure 3 Western blotting of mCherry-RIP3 fusion protein using anti-RIP3 antibody(A)and cellular localization(B)圖3 mCherry-RIP3融合蛋白的Western blot鑒定（A）與細胞定位（B）

Figure 4 The increased sensitivity of mCherry-RIP3 transfected MCF7 cells to TNF-α and Z-VAD-FMK induced cell necrosis圖4 mCherry-RIP3轉染后增強MCF7細胞對TNF-α聯合Z-VAD-FMK誘導的細胞壞死的敏感性

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