天津漢族胎兒D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座遺傳多態性研究*

李曉洲 劉 靜 史云芳 琚 端 李 巖 張 穎 岳天孚

18-三體綜合征（edwards syndrome，ES）是人類常見的染色體病，無法治療，只能通過產前診斷避免患兒出生，但傳統的產前診斷方法操作復雜，技術要求高，培養時間長，不能滿足產前診斷需要。且目前產前診斷的需求增大較快，因此快速產前診斷方法的建立迫在眉睫。短串聯重復序列（short tandem re?peat，STR）的多態性較豐富，定量熒光聚合酶鏈式反應（quantitative fluorescence polymerase chain reac?tion，QF-PCR）靈敏、快捷且自動化的特點[1]，兩者結合可作為快速基因診斷染色體數目異常的首選方法。但由于國內缺乏18號染色體STR基因座的遺傳學信息，因此很難實現對ES快速基因診斷，尤其限制其在產前診斷中的應用。本研究應用QF-PCR技術研究天津漢族胎兒18號染色體上D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座遺傳多態性，為ES的快速產前基因診斷提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 64例絨毛和374例羊水樣本取自2004年4月—2009年10月于我院產前診斷中心就診的438例高危妊娠婦女，孕周8～24周，均簽署產前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取絨毛0.5～1 mg或羊水1 mL，按本室常規方法提取DNA。

1.2.2 引物選擇 根據NCBI的UniSTS數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists），選擇 D18S53、D18S59和 D18S488 3個STR基因座并確定引物序列。正向引物5′端均由熒光染料 5-羧基-熒光素（caboxyfluorescein-5-succimidyl ester，FAM）標記，引物序列由北京鼎國生物技術有限責任公司合成，見表1。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反 應 體 系 25 μL：1×PCR buffer，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶0.04 U/μL，模板DNA約0.6 ng，引物濃度為0.12 μmol/L。PCR擴增條件：預變性94℃2 min；變性94℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃1 min，共35個循環；延伸72℃10 min，4℃保存。

1.2.4 PCR擴增產物檢測 PCR反應結束后，4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，ABI PRISM 377自動測序儀掃描電泳圖，用GeneScan 3.1軟件進行數據提取，安裝膠圖的Matrix文件，選擇合適內標并設置合適的分析參數，打開Binthere軟件，設置片段大小范圍，并把GeneScan 3.1軟件分析得到的數據導入，得到膠圖對應的峰圖及相關數據。根據分子內標記電泳位置，分析出電泳的DNA片段的大小及熒光信號峰面積。將等位基因片段由小到大順序排列并編號，據此得到各樣本的基因型。

1.3 統計學方法 數據用SPSS 13.0軟件進行分析，驗證是否符合H-W平衡定律（P＞0.05）。對表現為雜合子的個體，統計其峰面積比值的均數、標準差及95%參考值范圍。采用PowerStatsV12軟件進行統計分析，分別計算3個STR基因座的觀察雜合度（heterozygosity of observation，Ho）、多態信息量（polymorphism information content，PIC）、個體識別率（proba?bility of discrimination power，DP）、非父排除率（probability of exclusion，PE）等群體遺傳學數據。

2 結果

2.1 3個基因座基因頻率分布 438例樣本均擴增成功。D18S53 STR基因座共發現15種等位基因，片段長度為161～185 bp，由小到大依次命名為1～15，共發現52種基因型，分布符合H-W定律（χ2=23.94，P=1.00）。D18S59 STR基因座共發現13種等位基因，片段長度為128～152 bp，由小到大依次命名為1～13，共發現47種基因型，分布符合H-W定律（χ2=52.10，P=0.19）。D18S488 STR基因座共發現15種等位基因，片段長度為236～264 bp，由小到大依次命名為1～15，共發現42種基因型，分布符合H-W定律（χ2=45.11，P=0.23）。3個STR基因座等位基因頻率見表2，基因座電泳圖，見圖1。438例樣本的3個STR基因座共1 067個樣本表現為雜合子，2個峰的峰面積比值為0.50～1.76，x=1.06，s=0.21，95%CI：0.65～1.47，見圖2～4。

Table 2 The allele frequencies of STR loci D18S53,D18S59 and D18S488表2 D18S53、D18S59和D18S488 STR基因座等位基因頻率

2.2 遺傳多態性統計 天津漢族胎兒D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座Ho、PIC、DP和PE等群體多態性數據見表3。

3 討論

STR基因座即微衛星DNA，重復次數通常為15～30次。一般1個STR基因座有十幾個等位基因片段，其長度范圍約在400 bp以下，其核心序列多為(TG)n、(AAT)n、(GATA)n等，以(CA)n最常見，多存在于非翻譯區及內含子中。由于STR基因座的高度多態性及孟德爾共顯性遺傳等特點使其廣泛用于基因作圖、篩選目的基因、遺傳病連鎖分析、群體遺傳學研究、法醫個體識別和親權鑒定等方面。1991年Ed?wards等[2]首次應用STR-PCR建立第二代DNA指紋技術用以診斷X染色體單體疾病。1993年Mansfield等[3]首先以STR基因座作為21號染色體的遺傳標記，用QF-PCR對唐氏綜合征患者進行基因診斷，此后陸續有學者利用STR基因座的獨特優勢進行染色體數目異常診斷。

Table 1 The characteristics of STR loci D18S53,D18S59and D18S488表1 D18S53、D18S59和D18S488基因座特征

Figure 1 Electrophoresis result of D18S53,D18S59 and D18S488 STR loci圖1 D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座電泳圖

Figure 2 Results of GeneScan analysis of D18S53 STR locus圖2 D18S53 STR基因座GeneScan分析結果圖

Figure 3 Results of GeneScan analysis of D18S59 STR locus圖3 D18S59 STR基因座GeneScan分析結果圖

Figure 4 Results of GeneScan analysis of D18S488 STR locus圖4 D18S488 STR基因座GeneScan分析結果圖

Table 3 The genetic polymorphism data of three STR loci表3 3個STR基因座遺傳多態性數據

QF-PCR在英國乃至歐美國家已經廣泛應用于常見染色體非整倍體的快速診斷[4]，Hills等[5]回顧分析倫敦地區9 737例產前診斷樣本，發現73例母血污染嚴重的樣本單獨應用QF-PCR可明確診斷。由于國內缺少相關的科研數據，因此還無法將QFPCR應用于常見染色體非整倍體的快速診斷中。本研究分別選取18號染色體著絲粒附近、短臂和長臂各1個STR基因座，通過研究其群體遺傳學數據，為天津漢族群體ES基因診斷及產前基因診斷的研究提供實驗依據；并且通過對QF-PCR結果峰面積定量的統計分析，為建立應用該方法進行基因診斷及產前基因診斷的標準提供實驗依據。

目前國內外有關D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座的群體遺傳學數據鮮有報道，本研究結果顯示，天津漢族胎兒這3個STR基因座Ho、PIC、DP及PE值與本課題組前期有關天津漢族群體遺傳學數據一致[6]。一般認為所選取的STR基因座若Ho＞0.7、PIC＞0.5、DP＞0.8且PE＞0.5，則可作為良好的遺傳標記，故本研究選取的D18S53、D18S59和D18S488 3個STR基因座可作為18號染色體良好的遺傳標記，進一步用于ES的產前基因診斷。

QF-PCR以其經濟、高效的特點一直受國內外學者關注。Gekas等[8]通過對110 948例孕婦產前診斷方案的研究發現，QF-PCR方法每診斷1例DS比核型分析可節約3 494美元。因此有必要建立符合天津地區人群特點的QF-PCR診斷方案。由于相同STR基因座在不同個體可能出現不同長度的等位基因，則QF-PCR擴增STR后可能出現2種情況：純合子表現為1條帶/峰；雜合子表現為2條帶/峰，定量之比約為1∶1。本研究3個STR基因座共1 067個樣本表現為雜合子，2個峰的峰面積比值為0.50～1.76，x=1.06，s=0.21，95%CI：0.65～1.47，與Faas等[9]的研究結果一致。

[1]Scott F,Murphy K,Carey L,et al.Prenatal diagnosis using com?bined quantitative fluorescent polymerase chain reaction and array comparative genomic hybridization analysis as a first-line test:re?sults from over 1000 consecutive cases[J].Ultrasound Obstet Gyne?col,2013,41(5):500-507.

[2]Edwards A,Civitello A,Hammond HA,et al.DNA typing and ge?netic mapping with trimetric and tetrameric tandem repeats[J].Am J Hum Genet,1991,49(4):746-756.

[3]Mansfield ES.Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem re?peat polymorphisms[J].Hum Mol Genet,1993,2(1):43-50.

[4]Mann K,Ogilvie CM.QF-PCR:application,overview and review of the literature[J].Prenat Diagn,2012,32(4):309-314.

[5]Hills A,Donaghue C,Waters J,et al.QF-PCR as a stand-alone test for prenatal samples:the first 2 years’experience in the Lon?don region[J].Prenat Diagn,2010,30(6):509-517.

[6]劉靜,張穎,岳天孚.天津漢族人群18號染色體3個短串聯重復序列多態性[J].中國現代醫學雜志,2010,20(8):1164-1167.

[7]Hui L,Bianchi DW.Recent advances in the prenatal interrogation of the human fetal genome[J].Trends Genet,2013,29(2):84-91.

[8]Gekas J,van den Berg DG,Durand A,et al.Rapid testing versus karyotyping in Down’s syndrome screening:cost-effectiveness and detection of clinically significant chromosome abnormalities[J].Eur J Hum Genet,2011,19(1):3-9.

[9]Faas BH,Cirigliano V,Bui TH.Rapid methods for targeted prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies[J].Semin Fetal Neo?natal Med,2011,16(2):81-87.