HPLC法測定青果丸中黃芩苷的含量

王亦存（龍門縣人民醫院，廣東惠州 516800）

青果丸系中藥成方制劑[1-2]，由青果、金銀花、黃芩、北豆根、麥冬、玄參、白芍和桔梗8味中藥組成，具有清熱利咽、消腫止痛的功效，對于咽喉腫痛、失音聲啞、口干舌燥、肺燥、咳嗽具有較好的療效。方中黃芩的主要有效成分黃芩苷具有清熱解毒、抗炎、利膽、降壓、利尿、鎮靜、保肝、抗菌等多方面的藥理作用[3-6]。但是，目前相關文獻僅報道了對青果丸中綠原酸和芍藥苷進行含量測定[1，7]，并無對黃芩苷的含量進行測定的報道。因此，本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法測定了該制劑中的有效成分黃芩苷的含量。

1 材料

P680A型HPLC儀，包含SCL-6B系統控制儀、LC-9A泵、SIL-6B自動進樣器、C-R4A數據處理機等（美國Dionex公司）；UV-2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；AB265-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-200514，質量分數：99.1%）；青果丸（吉林某制藥廠，批號：120106、1210425、120718，規格：8g/袋）；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸等試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[8-10]

色譜柱：Agilent TC-C18（150mm×4.60mm，5μm）；流動相：甲醇-水-0.02mol/L磷酸（45∶55∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量10μl；檢測波長：278nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品適量，置于50ml量瓶中，加適量70%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成每1ml含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備[11]取樣品2g，研碎，取約l g，精密稱定，加硅藻土0.5g，加入70%乙醇溶液40ml，加熱回流2h，放冷，濾過，濾液置于100ml量瓶中，用少量70%乙醇溶液分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 取青果丸中除黃芩外的其他藥材，按制備工藝制成陰性樣品，再按“2.2.2”項下制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，陰性對照在黃芩苷色譜峰處未發現吸收峰，對黃芩苷的出峰沒有干擾，表明該方法的專屬性良好。

2.4 線性關系考察

精密移取“2.2.1”項下對照品溶液適量，分別稀釋制成每1ml含黃芩苷10、20、50、100、150、200μg的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各10μl，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。以黃芩苷質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程y＝15807x+19683（r＝0.9999，n＝6）。結果表明，黃芩苷檢測質量濃度在10～200μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定峰面積。結果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.67%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1210425）適量，分別于放置0、4、8、12、20、24h時精密吸取10μl注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積。結果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.83%，表明供試品溶液在24h內穩定性較好。

2.7 重復性試驗

取樣品（批號：1210425）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算含量。結果，黃芩苷的平均含量為7.87mg/g，RSD＝0.96%，表明本方法的重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：1210425）適量，共9份，分別按80%、100%、120%的比例精密加入“2.2.1”項下的對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定黃芩苷的峰面積并計算含量。結果，批號為120106、1210425、120718的樣品平均含量分別為7.48、7.87、8.06μg/g。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者利用二極管陣列檢測器在200～400nm波長范圍內掃描對照品溶液的吸收光譜，發現黃芩苷在278nm波長處有最大吸收，靈敏度高，干擾較少，所以最終選擇278nm為本試驗的檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本試驗先以甲醇-磷酸二氫鉀為流動相，考察了不同比例的出峰情況，結果發現峰形拖尾均嚴重，改為加入0.02mol/L磷酸溶液后峰形明顯改善，表明在甲醇-水-0.02mol/L磷酸（45∶55∶0.2，V/V/V）的條件下，能夠較好地分離樣品中的主峰與雜質峰，且峰形對稱，保留時間短，靈敏度高。方法學驗證表明，其精密度、穩定性、回收率和重復性均能滿足定量分析的要求。

3.3 研究的價值

從本試驗所測青果丸中黃芩苷的含量可知，產品中黃芩苷含量變化較大。筆者認為，藥材的產地及采收季節不同可能導致不同批次產品中黃芩苷的含量不同。故建議廠家加強對原料藥材的質量監控，并制定相應的指標。

綜上所述，本方法簡便、準確、重復性好，可用于青果丸中黃芩苷的含量測定。

[1]徐岳鑫.HPLC法測定青果丸中綠原酸的含量[J].中國藥師，2013，16（2）：255.

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[3]侯艷寧，朱秀媛，程桂芳.黃芩苷的抗炎機理[J].藥學學報，2000，35（3）：161.

[4]張喜平，田華，程琪輝.黃芩苷的藥理作用研究現狀[J].中國藥理學通報，2003，19（11）：1212.

[5]文敏，李雪，付守廷.黃芩苷藥理作用研究新進展[J].沈陽藥科大學學報，2008，25（2）：158.

[6]張建春，張華，施瑛，等.黃芩苷的研究近況[J].時珍國醫國藥，2005，16（3）：247.

[7]張蕾，張福堂.高效液相色譜法測定青果丸中芍藥苷的含量[J].河南中醫學院學報，2004，19（111）：20.

[8]劉常青，柯穎川，何百寅，等.HPLC法同時測定撤熱柴胡飲中連翹苷和黃芩苷的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：105.

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[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：797-798.