國內外不同廠家馬來酸依那普利片在4種溶出介質中溶出曲線的比較

孫 婷，姜建國，宋更申，張西如（河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050011）

考察在多種pH溶出介質中的溶出曲線是評價口服固體制劑內在質量的一種重要手段。該試驗可用于評估不同來源的同一品種制劑內在質量的差異[1]。馬來酸依那普利片系血管緊張素轉換酶抑制劑，是一種非處方藥，臨床上主要用于各期原發性高血壓、腎性高血壓、充血性心力衰竭等的治療。大量的臨床研究證明，馬來酸依那普利片在減輕左心室肥厚及胰島素抵抗方面優于其他部分降壓藥物，其已被公認為對靶器官有保護作用[2]。基于以上優點，目前國內市場上生產馬來酸依那普利片仿制藥的企業較多，而不同企業生產的仿制藥產品質量可能存在一定的差異，導致臨床療效反應不一。這種療效的差異與藥物生物利用度緊密相關[3]，而溶出度是反映藥物生物利用度最直接的方式。

本試驗參考有關文獻[4-6]，采用高效液相色譜（HPLC）法，按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩC第二法（槳法）進行操作[7]，比較了市售3個國內企業生產的馬來酸依那普利片與國外原研藥在4種不同pH溶出介質中的溶出曲線，以期為仿制藥質量一致性評價工作開展以及該制劑生產工藝提高提供參考。

1 材料

RC12A型溶出儀（天津天大天發科技有限公司）；Agilent 1260型HPLC儀，包括G1311C四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314紫外可變波長檢測器等（美國Agilent公司）；XS105型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

馬來酸依那普利對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100705-200902，質量分數：99.8%）；馬來酸依那普利片（國內A企業，批號：11081511，規格：每片5mg；國內B企業，批號：120401，規格：每片5mg；國內C企業，批號：12060802，規格：每片5mg；國外D企業——美國默沙東公司，批號：120849，規格：每片5mg）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、馬來酸和鹽酸均為分析純，試驗用水為去離子純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8（150m×4.6mm，5μm）；流動相：0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調pH至2.2）-乙腈（75∶25，V/V）；流速：1.0ml/min；檢測波長為215 nm；進樣量：50μl，柱溫：50℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 4種溶出介質的制備 pH 1.0鹽酸溶液：取鹽酸9.0ml，加水稀釋至1000ml，搖勻，即得。pH 4.5磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，加水稀釋至1000ml，搖勻，即得。pH 6.8磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，與0.2mol/L氫氧化鈉溶液112ml混合后，加水稀釋至 1000ml，搖勻，即得。水：為去離子純凈水（經測定pH為6.5）。上述4種溶出介質用水均采用脫氣裝置經40℃脫氣40 min后立即使用。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬來酸依那普利對照品約10mg，以甲醇溶解于100ml量瓶中，并稀釋至刻度。精密量取上述溶液適量，分別加相應的“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質定量稀釋制成每1ml中約含5μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品適量，按照《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅩC第二法（槳法），分別采用“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質，溶出介質體積900ml，溶出溫度（37.0±0.5）℃，轉速50r/min，依法操作，經時30min，取溶出液適量，濾過，作為供試品溶液。

2.2.4 空白對照溶液的制備 精密稱取馬來酸約10mg，以甲醇溶解于100ml量瓶中，稀釋至刻度。精密量取上述溶液適量，分別加相應的“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質定量稀釋制成每1ml中約含5μg的溶液，作為空白對照溶液。

2.3 系統適用性考察

取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各適量（溶出介質為水），按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，馬來酸依那普利峰保留時間約為6.0min，理論板數按馬來酸依那普利峰計算不低于900，拖尾因子應不大于2.0；在該色譜條件下，待測成分峰與溶劑及其他雜質峰分離良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密稱取馬來酸依那普利對照品約10mg，置于100ml量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、2、5、10、15、20ml，置于100ml量瓶中，分別加“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質稀釋至刻度，搖勻，分別量取50μl注入HPLC儀，記錄色譜。以馬來酸依那普利的質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程分別為 y＝99.27×105x+23.24×105（r＝0.9999）、y＝99.22×105x－10.34×105（r＝0.9999）、y＝99.23×105x－10.36×105（r＝0.9999）、y＝99.22×105x－10.35×105（r＝0.9999）。結果表明，馬來酸依那普利檢測質量濃度在1.0～20μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下4種對照品溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果，馬來酸依那普利峰面積的RSD分別為0.04%（pH 1.0鹽酸溶液）、0.02%（pH 4.5磷酸鹽緩沖液）、0.02%（pH 6.8磷酸鹽緩沖液）、0.03%（水），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取按“2.2.3”項下方法制備的供試品溶液（D企業樣品，批號：120849）適量，于室溫下放置，在12h內每隔2h進樣1次，測定峰面積。結果，馬來酸依那普利峰面積的RSD分別為0.66%（pH 1.0鹽酸溶液）、0.04%（pH 4.5磷酸鹽緩沖液）、0.23%（pH 6.8磷酸鹽緩沖液）、0.14%（水），表明供試品溶液在室溫放置12h穩定性良好。

2.7 回收率試驗

根據D企業樣品（批號：120849）處方，按處方量50%、80%、100%精密稱取馬來酸依那普利對照品，輔料按處方量100%稱取，每個水平各3份，置于不同的900ml量瓶中，分別用“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質稀釋制成4種待測溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.8 溶出曲線的繪制

取樣品12片，按《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅩC第二法（槳法），分別采用“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質，溶出介質體積900ml，溶出溫度（37.0±0.5）℃，轉速50r/min，依法操作，分別于5、10、15、20、30、45、60、90、120min時取溶出液適量（3～5ml），濾過（具備在線過濾功能的溶出儀無需重復濾過），取續濾液作為供試品溶液，并即時補充相同溫度相同體積的溶出介質，繼續試驗（當連續兩點的累積溶出率達85%以上，且差值在5%以內時，試驗可以提前結束）。另取馬來酸依那普利對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml中約含100μg的溶液。精密量取上述溶液適量，分別加相應的“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質定量稀釋制成每1ml中約含5μg的溶液，作為對照品溶液。精密量取上述供試品溶液和對照品溶液各50μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，按外標法以峰面積計算每片在不同時間點的累積溶出率。以12片的平均累積溶出率（%）為縱坐標，時間（min）為橫坐標，繪制溶出曲線，結果見圖2。

圖2 4種馬來酸依那普利片在不同溶出介質中的溶出曲線Fig 2 Dissolution curves of 4 kinds of enalaprilmaleate tab?lets in different mediums

2.9 溶出曲線的評價

采用美國食品與藥品管理局（FDA）推薦使用的f2相似因子法來評價國內企業仿制藥（試驗藥品）與國外原研藥（對照藥品）體外溶出曲線的相似性，以考察其內在質量的差異。f2計算公式如下：

式中，Rt為t時點對照藥品的溶出度；Tt為t時點試驗藥品的溶出度；n為取樣點的個數。f2從統計學上度量了兩條溶出曲線之間的相似性，f2值越大，說明兩條溶出曲線差異越小，若50≤f2≤100，可以推斷兩條溶出曲線相似；完全相同的兩條溶出曲線，其f2＝100。選擇合適的時間點進行國產馬來酸依那普利片在4種溶出介質中的溶出曲線的f2值計算，結果見表2。

3 討論

3.1 轉速的選擇

對國內A、B、C企業以及國外D企業樣品分別在“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質中進行50r/min和75r/min轉速對比。結果，50r/min和75r/min轉速下，樣品溶出曲線無顯著差異，參考USP35、《日本藥局方》16版馬來酸依那普利片溶出度測定的方法和轉速，同時考慮本品多數為中老年患者使用，而中老年患者通常胃蠕動較為緩慢，因此將轉速選定為50r/min。

表2 4種溶出介質中國產馬來酸依那普利片的溶出曲線的f2值Tab 2 The f2 factors of the dissolution curves of domestic Enalaprilmaleate tablets in 4 kinds of dissolution medium

3.2 方法的耐用性

對國內A、B、C企業和國外D企業樣品，分別采用Agilent ZORBAX XDB-C8（150mm×4.6mm，5μm）和Waters Sym?metry Shield RP C18（150mm×4.6mm，5μm）進行測定并對結果進行比較。結果表明，采用不同色譜柱所達到的理論板數基本一致，說明“2.1”項下色譜條件具有良好的耐用性。

3.3 溶解度的考察

精密稱取國外D企業樣品（批號：120849）共4份，每份約0.1g，分別加入到“2.2.1”項下不同pH溶出介質（3ml）中，置于（37.0±0.5）℃水浴中加熱24h（前2h，每30min振搖一次，每次約1min），24h后分別取上清液；同時取馬來酸依那普利對照品配制成15μg/ml的對照品溶液，同法操作。取上述兩種溶液分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，馬來酸依那普利在4種pH溶出介質中的溶解度分別為29、36、35、36mg/ml，說明選擇上述不同pH溶出介質進行溶出試驗具有可行性。

3.4 色譜條件的選擇

3.4.1 色譜柱的選擇 USP35、《日本藥局方》16版、《中國藥典》2010年版均選用C8柱測定馬來酸依那普利片的溶出度。通過以上耐用性試驗考察可知，采用C18柱與C8柱測定其溶出度，無明顯區別。因各國藥典均采用C8柱，具有一定的普遍性，因此本次試驗仍選用C8柱測定。

3.4.2 流動相的選擇 USP35、《日本藥局方》16版、《中國藥典》2010年版均采用了磷酸鹽溶液（用磷酸調pH至2.2）-乙腈作為流動相，不同之處是，USP35、《日本藥局方》16版采用磷酸二氫鈉，而《中國藥典》2010年版采用磷酸二氫鉀。鉀的離子強度大于鈉，離子強度增加將使得色譜柱理論板數增加，同時還會縮短馬來酸依那普利的保留時間，因此本試驗選擇采用磷酸二氫鉀。

3.5 試驗結果探討

本試驗結果表明，在《中國藥典》2010年版規定的溶出介質水中，3家國內企業生產的馬來酸依那普利片與國外企業生產的原研藥均可在30min時達到溶出標示量75%以上。然而，就“2.2.1”項下4種不同pH溶出介質中總體的溶出曲線而言，3家國內企業仿制藥樣品與國外原研藥樣品比較，僅有1家具有相似性。A企業樣品在4種溶出介質中均比原研藥樣品釋放速率慢，到達平臺期時間較長，且其自身在4種溶出介質中的溶出曲線亦存在差異；B企業樣品雖然到達平臺期的時間有所提前，但卻在上升期出現拐點，仍與原研藥樣品存在差異；C企業樣品與原研藥樣品的溶出曲線基本相似，但其自身在4種溶出介質中的溶出曲線仍存在一定差異。

3.6 思考與建議

溶出度試驗技術是評價口服固體制劑內在質量的一種重要手段，該試驗不僅可為建立其體內外相關性提供基礎數據，而且有望成為通過體外試驗評價其質量的簡易、有效、可行的方法。日本自1998年開始實施“藥品品質再評價工程”[8]，陸續出版了《醫部用醫藥品品質情報集》[即日本參比制劑目錄（橙皮書）]，其中詳細羅列了所收載制劑的4條標準溶出曲線。美國FDA藥品審評中心的仿制藥辦公室屬下的生物等效部也于2004年1月起，在其官方網站上推出了“固體制劑溶出曲線數據庫”[9]。目前我國雖未推出“溶出曲線數據庫”，但對口服固體制劑多條溶出曲線的測定已愈發受到關注與重視。我國于2012年開始實施“仿制藥質量一致性評價”工程。馬來酸依那普利片屬于非處方藥，即患者自主用藥。若各個廠家生產的制劑與療效較好的原研制劑存在較大差異，則患者容易在不知情的情況下遭受血壓的過度波動及過度變異，從而可能使重要器官受到損害。

由本試驗結果可見，用單點單一溶出介質檢測藥物體外溶出度，各樣品的最終溶出度結果都符合標準規定要求，而采用多種pH溶出介質時部分國內仿制藥樣品溶出曲線與原研藥樣品相比卻存在較大差異。因此，通過多pH溶出介質進行溶出試驗更能全面、準確地反映藥品的體外釋藥情況和內在質量，特別是反映了同一廠家不同批次同一樣品、不同廠家同一樣品間的質量差異，可為仿制藥質量一致性評價工作開展提供參考。因此，臨床應用時應多加注意，有必要加強對其多pH溶出曲線的實時監控，確保藥品質量的有效性、均一性和穩定性，以保障人民群眾用藥的安全性和有效性。

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[3]謝沐風.改善溶出度評價方法，提高固體制劑水平[J].中國醫藥工業雜志，2005，36（7）：447．

[4]劉紅，張關敏，張艷華.不同廠家枸櫞酸他莫昔芬片的體外溶出度考察[J].中國醫院藥學雜志，2012，32（6）：436.

[5]趙霓.不同廠家卡托普利片在4種溶出介質中的溶出曲線比較研究[J].中國藥師，2012，15（6）：845.

[6]謝沐風.溶出曲線相似性的評價方法[J].中國醫藥工業雜志，2009，40（4）：308.

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