RNA干擾沉默Survivin重組腺病毒質粒的構建

李日恒 胡曼輝 高 峰 張彩菊 張 瑞 朱 紅 王建博 魏 丹 劉玉英 蘇 葉 張愛民 安宇亮

程樹杰 (河北大學附屬醫院普外科，河北 保定 071000)

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中最有特點的一員，分子量最小，凋亡抑制作用最強。其氨基端只有一個BIR結構域，內含的一些氨基酸殘基Tip67、Pro33、Cys84發揮凋亡抑制作用;羧基末端由一個兩性α螺旋構成，調節Survivin的定位分布。研究表明Survivin在人的胚胎、胸腺、生殖腺、甲狀腺、神經干細胞、結腸上皮細胞等正常組織少量存在;在多種惡性腫瘤組織中高表達，在人類正常分化的組織中不表達〔1～4〕。RNA干擾技術(RNAi)通過雙鏈RNA(dsRNA)在細胞內誘導其同源特異性mRNA表達受抑制，從而引起基因轉錄后沉默〔5〕。通過RNAi技術，可以抑制含有特定序列的基因表達。本實驗目的是構建Survivin-siRNA重組腺病毒質粒，記默Survivin基因，抑制結直腸癌細胞。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎293T細胞ATCC細胞(上海拜立生物科技有限公司)，培養基 DMEM、0.25%胰酶、PBS、無血清培養基(北京清大天一科技有限公司)，腺病毒載體系Adenovirus Dual Expression Kit(pBAsi-Hh1，pBAsi-HU6，pBAsi-Mu6)，轉染試劑盒及回收試劑盒，BamH I、EcoR I，QDL2000 Quantitative DNA Marker等(大連寶生物工程有限公司)，瓊脂糖、LB肉湯培養基、甘油、液氮、SOC、卡那霉素、CsCl、病毒裂解上清液礦物等(北京世紀奧利生物技術有限公司)。

儀器:恒溫搖床(上海和呈儀器制造有限公司);分光光度計(上海光學儀器廠)、恒溫水浴鍋(上海百典儀器設備有限公司)、低溫高速離心機(湖南湘立科技儀器有限公司)、孵箱(Thermo上海米力光國際貿易有限公司);-80℃冰箱(海爾，北京天地精儀科技有限公司);EP管、方瓶、96孔板、透析袋等(北京清大天一科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 載體的構建 靶向Survivin基因寡核苷酸的設計:參考Reynolds設計原則制定shRNA的設計策略，選擇Survivin基因(基因序號為 NM_001168.2)，Survivin-shRNA的有效序列 :GGCTGGCTTCATCCACTGC(86～104)，上游引物序列:5'-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3';下游引物序列5'-TTATTCCCAT-GCGACGGTATC-3'，產物長度為186 bp，重組載體命名為pBAsisurvivin。設計長度為19 nt，寡核苷酸序列以正反向組合，中間添加含9個寡鏈核苷酸(TTCAAGAGA)的loop結構，使寡核苷酸形成發夾結構，兩端分別帶BamH I和EcoR I酶切位點，具體結構為BamH I酶切位點+正義鏈+發夾結構+反義鏈+終止信號TTTTTT+EcoR I酶切位點。合成靶序列的oligo DNA由大連寶生物技術有限公司合成。重組合成DNA序列:正義鏈: 5'-GATCCGGCTGGCTTCATCCACTGCTTCAAGAGAGCAGTGGATG-AAGCCAGCCTTTTTTG-3';反義鏈:5'-AATTCAAAAAAGGCTGGCTTCATCCACTGCTCTCTTGAAGCAGTGGATGAAGCCAGCCG-3'。陰性對照組為上述shRNA編碼序列打亂順序后編碼的產物，利用NCBI數據庫中BLaST檢索所選序列，不與任何人類、小鼠基因序列同源。對照組合成的 DNA序列:正義鏈:5'-GATCCGAGCTTGCCTAGCGTCCTCTTCAAGAGAGAGGACGCTAGGCAAGCTCTTTTTTG-3';反義鏈:5'-AATTCAAAAAAGAGCTTGCCTAGCGTCCTCTCTCTTGAAGAGGACGCTAGGCAAGCTCG-3'。各序列均含有59個寡鏈氨基酸，由大連寶生物科技有限公司合成上述單鏈。將合成好的oligo DNA稀釋到2 μg/ml，放到退火體系中混勻加熱95℃10 min，室溫靜置1 h，將冷卻產物稀釋到 100 倍，-20℃儲存備用〔6，7〕。1.2.2 Survivin shRNA重組腺病毒表達載體的構建 由BamH I和EcoR I酶切pBAsi-Hh1載體使其線性化，酶切反應體系包括純化的1 μg/μl DNA 質粒 2 μl;10 緩沖液 5 μl;100 × BSA 1 μl;10 U/μl的 BamH I 1 μl;10 U/μl的 EcoR I 1 μl;加 H2O至50 μl。將上述混合的反應物置于37℃1.5 h，將酶切產物在1%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，隨后切膠;用凝膠純化試劑盒進行分離純化。將退火產物雙鏈DNA與酶切線性化處理的pBAsi-Hh1載體片段連接，按質粒:目的基因線性片段=1∶5的比例進行反應，連接體系如下:0.1 μg/μl線性化載體 1 μl，100 ng/μl退火的雙鏈 DNA 1 μl，T4 DNA 連接酶 1 μl，10 × T4 DNA 連接酶緩沖液1 μl，加 dd H2O 至20 μl，于20℃過夜反應。最后將連接產物轉化到經氯化鈣法制備的DH5α感受態細胞，涂布于LB培養基平板上，37℃培養過夜。1.2.3 PCR鑒定及測序挑選重組陽性克隆行PCR鑒定 挑取8個菌落克隆抽提質粒、擴增，抽提的質粒經紫外分光光度計測定A260/A280，檢測質粒濃度和純度。使用載體多克隆位點兩端的引物進行PCR擴增，上游引物序列:5'-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3';下游引物序列為5'-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3'，PCR 產物5 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。挑選陽性克隆送DNA測序(大連寶生物工程有限公司)。

1.2.4 腺病毒重組體的包裝提取 將腺病毒包裝系統中三種質粒DNA，溶于除菌的TE中，用紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提取質粒DNA的D260/D280在1.8～2.0，用胰蛋白酶消化對數生長期的293ATCC細胞，向滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pBAsi-Hh1載體20 μg，pBAsi-HU6載體 15 μg，pBAsi-Mu6 載體10 μg)，將 DNA 與 Lipofectamine 2000混合液轉移至293ATCC細胞的培養液中，收集轉染后48 h的293T細胞上清液，4℃ 8 000 r/min離心10 min，除去細胞碎片，0.45 μm PVDF膜過濾，收集病毒置于-80℃低溫冰箱中保存。

2 結果

2.1 酶切法鑒定Survivin-siRNA重組腺病毒質粒 用BamH I和EcoR I雙酶切pBAsi-Hh1載體后線性化，與未經酶切載體比較，將線性化載體與DNA oligo連接，產物轉化DH5α感受態細胞，挑選陽性重組克隆PCR鑒定，重組克隆PCR片段為59 bp，未插入的空載體PCR片段為78 bp(圖1)，鑒定結果與預期相符，結果表明合成的survivin shRNA序列插入正確。

圖1 重組載體酶切結果

2.2 測序 經BamH I和EcoR I酶切產物進行雙酶切，將酶切產物送至大連寶生物工程有限公司，測序結果與設計的序列一致。證明重組質粒構建成功。見圖2。

圖2 重組腺病毒質粒pBAsi-Survivin測序結果

3 討論

Survivin的表達和分布特異性使其成為腫瘤診斷與治療的新靶點。張文淵等〔8〕檢測Survivin在宮頸癌中高表達，且與宮頸癌的臨床分期有關。Choi等〔9〕發現結直腸癌細胞中Survivin細胞核表達83.3%，并與結直腸癌的肝轉移密切相關。Survivin在結直腸癌中高表達，與結直腸癌的分化和預后密切相關。逆轉Survivin的表達能抑制腫瘤的生長。

RNA干擾是將靶基因序列同源的雙鏈RNA導入細胞，與靶基因mRNA結合，可以特異性阻斷體內某些特定基因的表達，促使靶基因mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因表達沉默的過程，特異性、穩定性、效率性和穿透性均較高，是唯一有可能進行長期基因沉默研究的方法，可直接用于癌癥相關基因的沉默，以達到疾病治療或預防的目的。RNA干擾研究使用的載體大多是質粒、逆轉錄病毒和脂質體等，這些載體攜帶的基因在細胞核內處于游離狀態，不能整合到染色體上，無法實現長期穩定的表達，因而在應用上受到一定的限制。而本研究采用的腺病毒載體能整合入宿主染色體，外源基因能夠長期穩定表達;宿主細胞免疫反應小，毒性小;能感染非分裂和分裂期細胞，具有巨大的應用潛力。本研究所采用的腺病毒載體系統由pBAsi-Hh1載體、pBAsi-HU6載體、pBAsi-Mu6載體三質粒組成，pBAsi-Hh1載體含有人類H1啟動子，使用RNA PolymeraseⅢ類啟動子，既可以直接作為質粒轉染細胞瞬間表達siRNA，也可以將“啟動子hairpin序列”切出后亞克隆至腺病毒載體，利用重組腺病毒載體進行siRNA的長期表達。而pBAsi-HU6載體，pBAsi-Mu6載體含有病毒包裝所必須的元件。本研究針對人survivin編碼區設計了一對shRNA，以復制缺陷型腺病毒作為載體，構建了特異性干擾survivin基因的腺病毒載體。與慢病毒載體和反轉錄病毒載體相比，腺病毒載體不轉染入染色體，在增殖與非增殖細胞內均可感染，感染效率基本上能達到100%。經PCR及測序鑒定證實病毒載體構建成功，經包裝產生的腺病毒具有較高滴度，為進一步探討 survivin沉默在結直腸癌SW480細胞中的生物學行為提供了基礎。

1 Yue ZJ，Carvalho A，Xu ZJ，et al.Deconstructing survivin:comprehensive genetic analysis of survivin function by conditional knockout in a vertebrate cell line〔J〕.J.Cell Biol，2008;183(2):279-96.

2 Wu SF，Zhang JW，Qian WY，et al.Altered expression of survivin，Fas and FasL contributed to cervical cancer development and metastasis〔J〕.European Rev Pharmacological Sci，2012;16:2044-50.

3 Hori M，Miki T，Okamoto M，et al.The detergent-soluble cytoplasmic pool of survivin suppresses anoikis and its expression is associated with metastatic disease of human colon cancer〔J〕.PLoS One，2013;8(2):e55710.

4 Wang YQ，Zhang HH，Liu CL，et al.Correlation between auto-antibodies to survivin and MUC1 variable number tandem repeats in colorectal cancer〔J〕.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2012;13(11):5557-62.

5 蔡 明，王國斌，陶凱雄，等.Livin靶向siRNA對大腸癌細胞凋亡的誘導作用〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2010;17(12):890-93.

6 彭冬先，何援利，丘立文.shRNA轉染對異位內膜細胞survivin基因的靶點抑制作用〔J〕.南方醫科大學學報，2010;30(4):859-63.

7 趙留芳.RNAi介導5urv1vin抑制鼻咽癌CNE一2裸鼠移植瘤的實驗研究〔D〕.2011，昆明醫學院.

8 張文淵，黃筱纮，平金良，等.Survivin、Fas在宮頸癌中的表達及意義〔J〕.腫瘤學雜志，2013;19(8):605-9.

9 Choi J，Chang H.The expression of MAGE and SSX，and correlation of COX2，VEGF，and survivin in colorectal cancer〔J〕.Anticancer Research，2012;32:559-64.