胎鼠間充質干細胞對老年小鼠肺功能的影響

朱錦燦 陳小宇 祝愛珍 劉成成 李 軍 劉革修 (暨南大學血液病研究所，廣東 廣州 510632)

間充質干細胞(MSCs)在體內的主要作用是通過形成新的組織間質結構，替代老化的間質結構，并能分化成多種新的組織細胞〔1〕。有研究報導小鼠MSCs能在小鼠體內分化成肺上皮細胞〔2〕。這提示補充生長狀態良好的MSCs有利于其發揮修復損傷作用，通過輸注MSCs可能起到延緩老年人肺的肺臟退行性變的作用。本研究對老年小鼠輸注外源性MSCs，觀察其對老年小鼠肺功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 孕13.5 d BALB/c小鼠4只，12月齡SPF級雌性BALB/c小鼠48只，體重(28±2)g，購于四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所，動物合格證號:SCXK(川)2004-15。將小鼠隨機分成移植組和對照組，每組24只。整個動物實驗均遵守中國科學技術委員會頒發的實驗動物管理條例。

1.2 材料 DMEM-F12液體培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，Vevo770?高分辨率小動物超聲系統(Visual Sonics公司)，血乳酸(BLA)(南京建成生物工程研究所)，地塞米松、胰島素、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤、抗壞血酸、β-磷酸甘油、茜素紅(Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 胎鼠MSCs的復蘇與培養 胎鼠MSCs的提取、培養與鑒定見文獻〔3〕，保存于本實驗室液氮中。使用時從液氮中取出凍存管，于37℃水浴中不斷攪動，使之迅速融化，吸出溶有細胞的凍存液加入事先準備好的液體培養基中(37℃預熱，10倍體積)的離心管中，吹打，低速室溫離心(1 000 r/min，5 min)，上清液后重新制備細胞懸液，接種于含10%胎牛血清的DMEMF12完全培養基(含青、鏈霉素各100 U/ml)中，于37℃ 5%CO2飽和濕度培養箱中培養，24 h后全量換液，每3天換液1次。

1.3.2 移植胎鼠MSCs 取第3代胎鼠MSCs(約107個細胞)以尾靜脈注射的方式，對移植組每只小鼠進行1次/月，連續注射3次胎鼠MSCs移植;同時在相同的條件下給予對照組小鼠注射等體積生理鹽水。

1.3.3 小鼠一般情況 對移植前后兩組小鼠進行形態改變、精神狀況以及活動度的觀察比較。

1.3.4 負重游泳試驗 隨機選取兩組小鼠各8只，于移植胎鼠MSCs 3個月后進行負重游泳實驗，其中游泳箱水深40 cm，水溫(25±0.5)℃，水流速度8 L/min，小鼠尾根部捆綁鉛皮(質量約為體重的5%)，記錄每只小鼠從放入水中至小鼠失去協調運動，10 s內未能浮出水面的時間，并取出小鼠，毛巾拭干。

1.3.5 血清乳酸含量測定 隨機選擇對照組和移植組小鼠各8只，分別在上述游泳箱里游泳5min，分別于游泳前、游泳結束0、5 min 3個時間點尾靜脈各取血20 μl，系統稀釋液稀釋后，血乳酸分析儀檢測各組小鼠血清中血乳酸的含量〔3〕。

1.3.6 超聲心動圖情況 于胎鼠MSCs移植前以及移植3個月后，分別從對照組和移植組中隨機各選取8只小鼠，用Vevo770?高分辨率小動物超聲系統測量各組小鼠肺動脈流速、心輸出量、左心室舒張末容積、每搏量。

1.3.7 組織學檢查結果 頸椎脫臼法處死全部小鼠，在肺相同部位取材，制作成石蠟切片后做肺組織學檢查，通過0～4分法雙盲打分法對小鼠肺臟組織衰老程度進行評價〔4〕。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件分析，計量資料采用s表示，行兩獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 移植后小鼠一般情況觀察 小鼠經3次胎鼠MSCs輸注后未見輸注對其造成不良影響。與對照組相比，移植組小鼠的活動量、精神狀態、毛發光澤度，食欲均有所改善。移植前以及移植3個月后兩組小鼠體重無顯著性差異。

2.2 MSCs對小鼠負重游泳時間的影響 移植MSCs 3個月后，與對照組小鼠負重游泳時間(982±65)s相比，移植組小鼠負重游泳時間(1 511±72)s有所增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 MSCs對小鼠運動前后血清乳酸的影響 經5 min游泳試驗后，對照組小鼠血清乳酸含量較運動前明顯增加，休息10 min后血乳酸水平有所下降，但仍高于運動前;移植組小鼠運動后血乳酸含量也有升高，但較對照組低，差異有統計學意義(P＜0.05)，休息10 min后移植組小鼠血乳酸值下降明顯，接近運動前的數值。見表1。

表1 移植MSCs對游泳實驗前后各組小鼠血清乳酸含量的影響(s，n=8，mmol/L)

表1 移植MSCs對游泳實驗前后各組小鼠血清乳酸含量的影響(s，n=8，mmol/L)

與對照組比較:1)P＜0.05

10 min對照組組別 游泳前 游泳結束0 min 游泳結束3.98 ±0.26 8.02 ±0.58 7.11 ±0.48移植組 3.75 ±0.31 7.23 ±0.391) 5.43 ±0.431)

2.4 超聲心動圖情況 移植MSCs 3個月后，經心臟超聲測量結果發現;移植組肺動脈平均血流速度較對照組(P＜0.05)。移植組中心臟輸出量、每搏輸出量、左室舒張期容積均較對照組小鼠高。見圖1。

2.5 組織學檢查結果 胎鼠MSCs移植3個月后，肺組織學檢查顯示，對照組肺臟的正常肺泡結構破壞，氣腔擴大，呈肺氣腫改變等肺退行性變化征象。而移植組肺退行性變化征象明顯減輕。通過評價組織衰老程度的0～4分法雙盲打分顯示對照組衰老程度〔(1.35 ±1.16)〕較移植組〔(2.5 士1.15)〕輕(P ＜0.05)。見圖 2。

圖1 超聲心動圖顯示兩組肺動脈流速對比

圖2 兩組肺組織學對比(×100)

3 討論

12月齡BALB/c雌性小鼠(平均壽命多報道為561 d)肺臟會出現老年小鼠肺衰老的組織病理學變化:肺泡間隔明顯增寬，局部肺泡腔消失，實性變，肺間質纖維結締組織增生，肺泡上皮細胞、毛細血管內皮細胞增生，呈老年性肺氣腫征象。因此我們在選取12月齡BALB/c雌性小鼠作為老年老鼠模型的基礎上，研究胎鼠MSCs能否改善老年小鼠的肺組織病理學及功能的退行性變化。首先我們成功提取胎鼠MSCs并通過流式細胞術、成脂油紅O染色及成骨茜素紅染色實驗鑒定了我們的實驗細胞為MSCs。接著對移植組小鼠輸注胎鼠MSCs 3個月后，通過與對照組做對比，發現小鼠做負重游泳試驗及限時游泳后檢測血清乳酸含量發現移植胎鼠MSCs能有效提高運動耐力，從側面反映了移植胎鼠MSCs后，其心肺功能較對照組有所改善。超聲心動圖檢查后發現移植MSCs后的小鼠左心功能各指標(心輸出量、左心室舒張末容積、每搏量)均有明顯的改善，與已有研究報道一致〔5〕，肺動脈流速也明顯下降。說明移植胎鼠MSCs后，小鼠的肺循環有明顯改善。同時組織切片顯示小鼠肺臟組織學衰退減輕。

以往研究發現，當將老年動物的細胞置于年輕動物的血液中，能起到使衰老的細胞變得年輕的作用〔6〕。在本實驗中我們通過小鼠負重游泳及限時游泳后檢測血清乳酸含量游泳前后的變化間接說明移植MSCs后小鼠的心肺功能有所改善，運動耐力有所提高。因為心肺功能的增強能為其運動時提供足夠的氧及能量，從而增加了有氧代謝，減少無氧酵解，達到減少了乳酸生成的作用。同時增強肝臟對乳酸的分解，提高機體耐力。同時，小鼠超聲心動圖檢查直接證明小鼠的左心功能有所改善，與此同時，肺動脈血流速度的減慢，說明了肺動脈壓的下降，老年小鼠常見的老年性肺氣腫有所改善。聯合左心功能的改善及肺循環的改善，共同證明這胎鼠MSCs能改善老年心肺功能。對于胎鼠MSCs之所以能延緩老年小鼠肺的組織學衰老及改善肺功能衰退，可能通過以下機制:MSCs在肺內的植入后通過分化為肺泡上皮細胞〔7～9〕(Ⅰ型肺泡上皮細胞〔7〕或Ⅱ型肺泡上皮細胞〔8〕)或分化為血管內皮細胞〔10〕，改善肺毛細血管網，從而改善肺組織的供血供氧和肺換氣功能。或者隨著MSCs在肺內的植入，分泌相關的多種細胞因子，最后達到修復肺組織的老化損傷，逆轉肺氣腫征象的作用。與此同時，向全身各組織器官輸送氧量增加，肺循環的改善對左心功能的改善起到積極作用。

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