糖尿病大鼠肝臟syndecan-1和蛋白激酶C的表達變化

王靜波 (解放軍第309醫院眼科，北京 100091)

肝臟是糖尿病(DM)受累的重要靶器官之一。DM患者由于對糖的利用障礙，需動員大量的脂肪，從而使游離脂肪酸過多流入肝臟。而游離脂肪酸在肝臟中進一步轉化成甘油三酯(TG)，并促進極低密度脂蛋白(VLDL)的合成和分泌，從而導致以TG和VLDL升高為主的高脂血癥。syndecan是硫酸肝素蛋白多糖家族成員。脊椎動物syndecan家族包括4個成員，即syndecan-1、-2、-3和-4。syndecan-1是 syndecan家族中研究最多、作用最廣泛的成員，可參與細胞的分化、黏附和移行，在炎癥、組織損傷和修復、脂質代謝等病理生理過程中起重要作用〔1〕。筆者既往的研究〔2～4〕表明，syndecan-1 可能參與糖尿病及其并發癥的發生發展，但syndecan-1在DM肝臟中的表達尚不明確。本研究觀察DM大鼠肝臟syndecan-1和信號通路蛋白激酶C(PKC)的表達變化。

1 材料與方法

1.1 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，美國)，兔抗鼠syndecan-1多克隆抗體、小鼠抗大鼠PKC多克隆抗體(Santa cruz公司，美國)，枸櫞酸鹽粉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑、二步法免疫組化檢測試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒、蘇木素(北京中杉金橋生物技術有限公司，北京)，安穩血糖儀及血糖測試條(長沙三諾有限公司)，冷凍包埋劑(櫻花，美國)。

1.2 實驗動物及模型制備 36只雄性SD大鼠，無特定病原體(SPF)級，體質量(120±20)g，由軍事醫學科學院動物中心提供。大鼠在SPF級動物中心飼養，室內溫度保持在25℃左右，濕度約50%。明暗周期12 h，自由飲水和進食。適應性喂養1 w后，進行動物造模。造模前，禁食12 h(不禁水)。隨機選取30只大鼠，STZ 65 mg/kg腹腔注射。對照組(6只SD大鼠)腹腔注射等量的枸櫞酸鹽溶液。72 h后測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。每周監測血糖。30只大鼠中，STZ成功誘導DM大鼠27只(90.0%)，死亡2只(7.4%)。對照組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動作自如，反應靈敏。DM大鼠建模成功后，大鼠出現了典型的“三多一少”癥狀，多飲、多食、多尿，明顯消瘦，精神逐漸萎靡，早期多動，后期反應遲鈍，動作緩慢，毛豎而無光澤。

1.3 標本制備 造模成功后第3、6、9、12、15周(每個時間點隨機選取5只大鼠)，分別采用過量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝臟。切取塊狀肝臟大葉組織，冷凍包埋劑包埋，連續切出5 μm厚度切片，貼于免疫組化專用防脫載玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4 免疫組化染色及結果判讀 冰凍切片用PBS沖洗，3%過氧化氫溶液室溫10 min，PBS洗;稀釋的syndecan-1抗體(1∶200)或PKC抗體(1∶200)室溫孵育2 h，通用型IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體37℃ 20 min，PBS洗，DAB顯色，PBS洗;蘇木素復染，自然水沖洗;梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹膠封片，照相。所有切片由同一個經驗豐富的病理科醫師盲法閱片做出判定，每張切片觀察5個×400倍視野。以組織切片背景清晰、細胞膜、細胞質染為淡黃至棕黃色為陽性細胞標志。結果判定標準:不著色為陰性，淡黃色及著色細胞＜1/3為弱陽性，黃色及著色細胞占1/3～1/2為中度陽性，棕褐色著色陽性細胞＞1/2為強陽性。

2 結果

2.1 肝臟syndecan-1的表達 syndecan-1的表達位于細胞質和細胞膜。在對照組大鼠，肝細胞排列整齊，syndecan-1呈陰性表達。DM 3 w時，大鼠肝細胞syndecan-1呈弱陽性表達。6 w時，肝細胞的胞質內可見小空泡，肝細胞syndecan-1呈強陽性表達;DM 9 w肝細胞的胞質內可見小空泡和15 w時肝細胞水腫明顯，肝細胞syndecan-1的表達進一步增強，呈強陽性表達。見圖1。

圖1 大鼠肝細胞syndecan-1的表達(免疫組化，×400)

2.2 肝臟PKC的表達 PKC的表達定位于細胞質。在對照組大鼠，肝細胞PKC呈陰性表達。而在DM大鼠，3 w時肝細胞PKC呈弱陽性表達;隨著DM病程增加，PKC的表達逐漸增強。糖尿病6 w時肝細胞的胞質內可見小空泡，肝細胞PKC呈中度陽性表達;9 w肝細胞的胞質內可見小空泡和15 w時，肝細胞PKC呈強陽性表達。

圖2 大鼠肝細胞PKC的表達(免疫組化染色×400)

3 討論

2型糖尿病(T2DM)患者肝臟病變的標準死亡率遠遠高于心血管并發癥的標準死亡率。DM肝臟病變包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝細胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常見的是非酒精性脂肪肝病，其在T2DM患者中發病率達50%，在 DM 伴肥胖患者中發病率近100%〔4，5〕。

既往，國內外研究者對syndecan-1的研究主要圍繞在該分子在組織損傷修復和炎癥中的作用。研究〔1〕表明，syndecan-1是介導肝脂質代謝的首要蛋白多糖成分，在脂質代謝中起重要作用。該分子定位于肝細胞基底膜的微絨毛上，介導肝細胞對乳糜顆粒及 VLDL 殘粒脂蛋白的結合與攝取〔1，6～9〕。syndecan-1的合成一旦被抑制，肝細胞對殘粒脂蛋白的結合和攝取會明顯減低〔1，6〕。在syndecan-1基因敲除的小鼠，肝臟細胞對TG的清除緩慢，對VLDL的結合、攝取和降解減慢〔1，6〕，血中TG含量明顯升高。外源性補充syndecan-1后，TG的代謝恢復正常〔6〕。筆者既往的研究表明，DM患者血清中可溶性syndecan-1的水平與載脂蛋白A1呈負相關〔1〕。

研究表明，多數DM患者血中TG和VLDL明顯升高〔1〕。筆者分析，過多的脂蛋白會刺激肝細胞表達多量syndecan-1以加速對脂蛋白的清除。但DM狀態下，肝細胞syndecan-1表達上調的信號通路尚不明確。

DM并發癥的發病機制十分復雜，包括非酶糖化作用增強、氧化還原反應、醛糖還原酶的激活及信號轉導系統的激活。近年來，倍受關注的信號轉導系統是二酯酰甘油(DAG)-PKC的激活。目前已發現哺乳動物PKC家族至少包括11種異型體(α、β1、β2、γ、δ、ε、ζ、η、θ、λ 及 μ)。DM 狀態下，持續的高血糖使細胞內葡萄糖流量增加，葡萄糖代謝所引起的3-磷酸甘油醛生成增加，從而導致DAG合成增加。DAG為PKC的內源性激活劑。當細胞內DAG含量增加，可促使PKC移位至細胞膜而被激活。PKC通路的異常變化可能是高血糖引起的各種紊亂的共同通路〔10〕。PKC的持續激活可引起細胞損傷，久之則引起DM慢性并發癥〔11〕。本研究發現，早期DM大鼠肝細胞內的PKC即被激活，并隨著糖尿病病程的增加而呈明顯升高趨勢。筆者推測并分析，PKC的激活在DM肝病的發病中起著重要作用。Jung等〔12〕研究表明，PKCδ是通過對syndecan-1的調控而影響細胞黏附功能。在DM肝病的發病機制中，PKC是否可以通過調控syndecan-1而影響脂蛋白的代謝尚不清楚。

綜上，在DM肝臟病變中，肝細胞syndecan-1蛋白的表達明顯增強，肝細胞的PKC通路也被激活。但在DM肝病中，PKC與syndecan-1的相互作用及二者對肝臟脂蛋白代謝的具體作用及其機制尚不明確，需通過更深入的研究進一步證實。

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2 Wang JB，Zhang YJ，Guan J，et al.Enhanced syndecan-1 expression on neutrophils in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Acta Diabetol，2012;49(1):41-6.

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5 王蓉蓉，謝 琳，吳曉燁，等.銀杏葉提取物對實驗性2型糖尿病大鼠肝臟的保護作用〔J〕.中國病理生理雜志，2007;23(3):566-9.

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11 Koya D，King GL.Protein kinase C activation and the development of diabetic complications〔J〕.Diabetes，1998;47(6):859-66.

12 Jung SY，Kim JM，Kang HK，et al.A biologically active sequence of the laminin alpha2 large globular 1 domain promotes cell adhesion through syndecan-1 by inducing phosphorylation and membrane localization of protein kinase C delta〔J〕.J Biol Chem，2009;284(46):31764-75.