益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠絲裂原和應激激活蛋白酶1表達的影響

胡亞男 劉愛東 公培剛 郭江燕 張家穎 尚曉玲 (長春中醫藥大學，吉林 長春 307)

中樞神經免疫性疾病多發性硬化癥(MS)伴隨髓鞘退化和軸突變性可導致永久性神經損傷，以益腎、解毒、通絡立法的中藥復方益腎達絡飲對MS有較好的治療效果〔1〕。前期研究顯示益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發病中致炎因子、P38、β淀粉樣前體蛋白等均有一定影響〔2～4〕。本文應用髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)免疫SJL小鼠，構建MS實驗動物模型，探討MS的發病機制及中藥治療與絲裂原和應激激活蛋白酶(MSK1)的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8～12周齡的SJL/J雌性小鼠24只，體重18～20 g，由美國Jackson實驗室提供，動物飼養在吉林大學實驗動物中心。SJL/J小鼠在實驗前清潔飲水，自由飲食。

1.2 實驗藥品與試劑來源 抗原PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)多肽購自北京賽百盛生物工程公司，純度95%以上。百日咳桿菌購自北京生物制品研究所，完全福氏免疫佐劑購自美國sigma公司，醋酸潑尼松購自天津天藥藥業股份有限公司(批號1006042)。醋酸潑尼松經研缽粉碎后以雙蒸水溶解，充分混勻，配成0.039%濃度。4℃保存，使用前混搖均勻。益腎達絡飲(由熟地、鹿角膠、梔子、石菖蒲、生甘草等組成)飲片購自長春中醫藥大學附屬醫院藥房，經常規方法煎煮后制成2 g生藥/ml的水提物，分裝滅菌后4℃保存備用。中藥按每公斤體重20 g生藥量給予小鼠灌胃。SB203580購自美國Sigma公司，用2%二甲基亞楓(DMSO)溶解成1 mmol/L的溶液。Anti-MSK1單抗、anti-CREB單抗購自Cell Signaling公司。辣根過氧化物酶標價二抗購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。RIPA蛋白裂解液(中)、預染蛋白分子量標準、ECL化學發光試劑盒購自Beyotime公司。PVDF膜為Bio-Rad公司產品。垂直蛋白電泳儀為北京六一儀器廠生產。半干電轉儀為大連競邁生物科技有限公司產品。

1.3 動物模型制備 用PLP139-151抗原免疫小鼠:將100μl PLP139-151 水溶液(含 PLP139-151 150 μg)與 100 μl完全福(氏)免疫佐劑(含結核桿菌H37RA 400 μg)混合，充分乳化制成油包水的抗原配劑。第1天給予SJL/J小鼠上腹部皮下注射0.2 ml的抗原配劑，第1天和第3天給予靜脈注射0.1 ml(含0.6×106個百日咳桿菌)百日咳桿菌液。

1.4 動物分組及給藥 實驗小鼠隨機分為正常組、模型組、激素組、中藥組、中藥+激素組、抑制劑組，每組4只。正常組不作任何處理，模型組造模后第7天開始每天給予生理鹽水0.2 ml灌胃14 d，中藥組造模后第7天開始每天按每公斤體重2 g生藥量給予益腎達絡飲0.2 ml灌胃14 d，激素組造模后第7天開始每天按每公斤體重0.078 mg藥量給予0.2 ml醋酸潑尼松灌胃14 d;中藥加激素組造模后第7天開始每天按每公斤體重2 g生藥量及0.078 mg醋酸潑尼松給予混合溶液0.2 ml灌胃14 d;SB203580組按照5 mg/kg的藥量腹腔注射 SB203580〔5〕，造模后第7天給藥1次，此后1次/6 d，共給藥3次。

1.5 神經功能評價 免疫后所有動物每天稱體重并進行神經功能評價，動物發病程度的判斷根據Kono等〔6〕提出的標準，發病后動物出現不同程度的神經功能缺損，可見動物尾部無力，尾部無力加肢體無力，肢體輕度麻痹，肢體嚴重麻痹，被動翻身后不能復原和瀕死狀態。

1.6 MSK1免疫蛋白質印跡法檢測 取造模后22 d時間點小鼠腦標本，放入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑)中，使用電動勻漿器低溫條件下勻漿，漿液離心后取上清即得到蛋白溶液。BCA蛋白濃度分析試劑盒測定蛋白濃度。酶標儀測定波長為A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。取一定量的蛋白樣品進行SDS-PAGE后，將凝膠中的蛋白采用半干轉移法轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉/TBS-T封閉。加入一抗(1∶1 000稀釋)及二抗(1∶5 000稀釋)，SmartChemiⅡ型ECL化學發光成像儀進行顯影，應用Image J計算蛋白條帶的灰度值。與內參做比值后進行分析(以Tubulin為內參)。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件處理。實驗數據以s表示，進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，經One-Way ANOVA進行方差齊性檢驗后，選用S-N-K進行多組比較。

2 結果

中藥組、模型組CREB與其余各組相比均顯著升高(P＜0.01)，中藥加激素組高于正常組(P＜0.01)。中藥組、激素組、中藥加激素組、抑制劑組4組的CREB水平由高到低為:中藥組＞激素組＞抑制劑組＞中藥加激素組(兩兩比較P＜0.01)。正常組及中藥加激素組CREB的水平均低于各組，這兩組之間比較均沒有明顯差異(P＞0.05)。

檢測腦組織中MSK1表達顯示，正常組和中藥組、激素組、抑制劑組均有顯著性差異(均P＜0.01);模型組和激素組、抑制劑組有顯著性差異(均 P＜0.01)，與中藥組有差異(P＜0.05);中藥組和激素組、抑制劑組有顯著性差異(P＜0.01)，與模型組、中藥加激素組有差異(P＜0.05)。見圖1，圖2。

圖1 MSK1、CREB免疫蛋白印跡結果

圖2 MSK1、CREB灰度值折線圖

3 討論

MS是一種累及中樞神經系統的自身免疫性疾病，臨床表現為麻木、痙攣、癱瘓、語言障礙、智力障礙及精神癥狀等，嚴重影響患者的生存質量。北京中醫藥大學高穎教授的研究團隊創立了以益腎、解毒、通絡立法的中藥復方益腎達絡飲，對MS有較好的療效〔1～4，7〕。EAE 的發病機制、病理特點與 MS極為相似，EAE小鼠是研究MS的經典動物模型〔5〕。以往研究表明EAE發病與P38絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路密切相關〔1〕，MAPK信號轉導通路中P38或ERK激酶通過級聯磷酸化激活 MSK，MSK直接磷酸化的下游底物還包括CREB、NF-κB等轉錄因子以及多個非轉錄相關蛋白。MSK是一類核內絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK通路的下游媒介分子，參與MAPK信號通路介導的下游基因轉錄調控和表觀遺傳學調控。因此，MSK廣泛參與腫瘤轉化、炎癥反應、神經突觸可塑性等生物學事件。MSK1作為CREB的上游激酶之一，可使CREB的Ser133的位點磷酸化而激活〔8〕，CREB激活對維持腦損傷后神經元的再生、存活及修復起重要作用〔9，10〕。

SB203580是一種常用的P38 MAPK抑制劑，可以通過細胞抑制P38 MAPK(p38 MAP kinase)，抑制后續MAPKAP Kinase-2和MAPKAP Kinase-3的激活。通過抑制P38MAPK，SB203580可以有效抑制一些炎癥因子(如IL-1β、TNF-α)誘導的部分信號轉導。在阻斷P38MAPK信號通路向核內傳遞時，一定程度上可以阻止CREB的磷酸化。先前的研究〔7〕表明SB203580能夠明顯降低EAE小鼠的神經功能評分，益腎達絡飲治療EAE的機制與調節P38MAPK這一細胞信號轉導通路密切相關。本研究結果提示中藥和激素、抑制劑均影響MSK1的表達，EAE發病中激活P38 MAPK信號轉導通路，中藥、激素與抑制劑均有治療作用;且呈p38MAPK信號通路下游因子MSK1表達與及其底物CREB表達呈相同態勢，EAE小鼠核蛋白CREB表達隨P38 MAPK信號轉導通路激活而增加。

中樞神經損傷后引發的信號轉導網絡變化非常復雜，損傷后的修復并非由單一信號通路決定，而是多因素多通路錯綜變化的復雜過程。

1 Shang XL，Gao Y，Yin L，et al.Effects of Yishendaluo decoction on axonal degeneration，inflammatory reaction，and neurological function in a mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.Neural Regen Res，2009;4(11):928-34.

2 尚曉玲，高 穎，尹 嶺，等.益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎MCP-1的影響〔J〕.天津中醫藥，2006;23(5):404-7.

3 尚曉玲，高 穎，尹 嶺，等.益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠ICAM-1的影響〔J〕.中醫藥臨床雜志，2007;19(2):123-5.

4 尚曉玲，高 穎，尹 嶺，等.益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎β淀粉樣前體蛋白的影響〔J〕.中國中醫基礎醫學雜志，2008;14(9):664-6.

5 Wei S，Benjamin J，Daniel BJ，et al.Drugs designed to inhibit human p38 mitogen-activated protein kinase activation treat toxoplasma gondii and encephalitozoon cuniculi infection〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2007;15(12):4324-8.

6 Kono DH，Urban JL，Horvath SJ.Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice〔J〕.J Exp Med，1988;168(1):213-27.

7 高 穎，關東升，婁麗霞，等.益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎p38MAPK信號轉導通路的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2011;26(2):267-70.

8 Schiller M，B?hm M，Dennler S，et al.Mitogen-and stress-activated protein kinase 1 is critical for interleukin-1-induced，CREB-mediated，cfos gene expression in keratinocytes〔J〕.Oncogene，2006;25(32):4449-57.

9 Lonze BE，Ginty DD.Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system〔J〕.Neuron，2002;35(4):605-23.

10 Walton MR1，Dragunow I.Is CREB a key to neuronal survival〔J〕?Trends Neurosci，2000;(2):48-53.