不同粒徑納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用

高艷榮 余艷琴 賈玉巧 高冰 白鋼 郝金奇

(包頭醫學院公共衛生學院，014060)

納米材料(nanomaterial)是應用納米技術制造的具有納米尺度(粒徑在1～100 nm之間)及特殊理化性質的物質[1]。納米SiO2是我國目前產量最大的納米材料之一，已經被廣泛應用于塑料工程、生物醫學工程、殺菌劑、食品加工等多個領域[2-3]。這就意味著納米SiO2的研究者、生產者、消費者乃至消費品處理者以及其進入環境后涉及的整個生態系統接觸它的機會大大增加。有研究發現多數納米顆粒物的毒性都比同質量微米級顆粒物要強，納米顆粒物有可能進入機體，并穿過體內的生物屏障系統到達微米顆粒物所不能到達的區域，如肺間質、循環系統、生殖系統，甚至細胞內，一些原本無毒或低毒的微米級顆粒材料當粒徑達到納米級時，毒性顯著增強[4-5]。因此，納米SiO2對人體健康和生態環境的潛在危害已經引起人們極大的關注。本文研究了不同尺度納米和常規SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用，試圖探討不同粒徑納米和常規SiO2對多種組織器官的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠80只，雄性，體質量(200±20)g，購于中國食品藥品檢定研究所，動物質量合格號SCKK(京)2009-0017，動物購進后適應性飼養1周，飼養室內溫度(22±2)℃，相對濕度40%～70%，動物自由飲水、攝食。20 nm SiO2、60 nm SiO2購于Sigma公司，微米SiO2(粒徑為0.1～5μm)購于天津市科密歐化學試劑有限公司。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、TBA、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和染塵 80只大鼠隨機分為10組，每組8只，分別為20 nm SiO2高、中和低劑量組，60 nm SiO2高、中和低劑量組，微米SiO2高、中和低劑量組和陰性對照組。將20 nm SiO2、60 nm SiO2和微米SiO2用生理鹽水分別配成67.5 mg/mL、22.5 mg/mL和7.5 mg/mL高、中、低3個濃度的混懸液，用漩渦攪拌器不斷攪拌，大鼠用0.3%巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用非暴露氣管插管式按給大鼠染塵，陰性對照組經氣管注入等體積的生理鹽水。染毒48 h后處死大鼠，取出肺、肝、睪丸組織，進行各項指標的測定。

1.2.2 指標測定 染塵48 h后采用麻醉后腹主動脈放血法處死大鼠，摘取肺、肝、心、睪丸組織，分別稱取0.5 g，加4.5 mL冷生理鹽水，冰水浴下制成10%的勻漿。黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，DTNB直接法測定GSH-Px含量，通過測定硫代巴比妥酸反應物(TBARS)的含量，以表示脂質過氧化作用(LPO)水平，組織蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.3 統計方法 采用Excel建庫，SPSS 13.0軟件統計分析。組間比較采用方差分析(ANOVA)，均數間多重比較用最小極差法(LSD)，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、睪丸組織SOD酶活性的影響(表1)由表1可知，隨著劑量逐漸增加，20 nmSiO2和60 nm SiO2均可引起大鼠肺、肝和睪丸組織SOD酶活性逐漸降低。在67.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2和60 nm SiO2組的肺和肝臟SOD酶活性與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且20 nm SiO2組大鼠心臟SOD酶活性與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，在22.5 mg/kg劑量下，肺和肝臟SOD酶活性與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。與陰性對照組比較，微米SiO2只引起肺組織SOD酶活性降低(P＜0.05)。

表1 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、睪丸組織SOD酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

表1 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、睪丸組織SOD酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 肺臟 肝 心 睪丸陰性對照組 0 115.23±10.84 147.33±13.51 107.75±10.84 90.74±8.63 20 nm SiO2組 7.5 98.33±18.34 136.17±25.14 117.63±18.34 87.51±11.71 22.5 71.47±12.70* 95.60±13.80* 98.47±15.16 83.60±6.81 67.5 60.36±10.94* 83.67±18.38** 81.73±12.70* 62.59±7.54*60 nm SiO2組 7.5 107.50±10.91 137.49±23.67 108.15±11.74 81.74±10.91 22.5 93.73±9.24* 113.83±14.84* 95.33±15.43 85.34±13.18 67.5 63.61±13.71* 94.73±21.80* 97.06±22.67 70.83±9.57*微米SiO2組 7.5 113.12±17.69 147.38±19.29 104.08±16.67 90.83±17.41 22.5 98.67±12.29* 145.70±20.85 103.5±17.37* 95.61±13.60 67.5 80.91±13.41* 131.84±22.73 97.6±27.4 91.08±10.87

2.2 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織GSH-Px酶活性的影響(表2) 由表2可知，隨著劑量逐漸增加，20 nm SiO2和60 nm SiO2均可引起大鼠肺、肝和睪丸GSH-Px酶活性逐漸降低。肺、肝臟在67.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2和60 nm SiO2組的GSH-Px酶活性與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。在22.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2組的肺、肝組織GSH-Px酶活性也顯著低于對照組(P＜0.05)。各實驗組大鼠心臟GSH-Px酶活性與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。微米SiO2只引起肺組織GSH-Px酶活性降低(P＜0.05)。

表2 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織GSH-Px酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

表2 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織GSH-Px酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 肺臟 肝 心 睪丸陰性對照組 0 51.80±4.63 65.41±5.42 45.53±4.71 38.16±5.74 20 nm SiO2組 7.5 51.50±3.07 58.62±5.69 46.23±4.58 37.43±3.81 22.5 39.18±3.64* 45.73±5.64* 43.65±6.20 34.54±3.58 67.5 32.71±3.07** 41.85±6.48* 31.82±3.77* 27.52±3.40*60 nm SiO2組 7.5 47.33±4.80 62.73±4.75 40.83±4.90 38.61±4.18 22.5 34.17±3.71* 52.80±4.50 40.75±4.09 34.56±4.53 67.5 32.94±4.73* 41.77±5.07* 36.48±6.49 30.50±3.46微米SiO2組 7.5 48.20±5.40 64.77±4.08 46.83±5.19 39.67±4.16 22.5 40.67±6.10 57.67±7.15 42.84±5.10 36.09±5.44 67.5 38.06±5.17* 58.43±6.45 43.52±4.76 35.16±6.50

2.3 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織TBARS水平的影響(表3) 由表3可知，隨著劑量逐漸增加，20 nm SiO2和60 nm SiO2均可引起大鼠肺、肝和睪丸TBARS含量逐漸升高。在67.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2和60 nm SiO2組的肺、肝和睪丸組織TBARS含量與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且20 nm SiO2組大鼠心臟TBARS含量與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，其他各實驗組大鼠心臟TBARS含量與陰性對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，在22.5 mg/kg劑量下，肺、肝組織TBARS含量也顯著低于陰性對照組(P＜0.05)。微米SiO2使肺組織TBARS含量升高(P＜0.05)。

表3 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織TBARS水平的影響(±s，n＝8，nmol/mgprot)

表3 納米和常規微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織TBARS水平的影響(±s，n＝8，nmol/mgprot)

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 肺臟 肝 心 睪丸陰性對照組 0 0.31±0.02 0.42±0.03 0.32±0.01 0.29±0.01 20 nm SiO2組 7.5 0.33±0.05 0.43±0.04 0.33±0.03 0.31±0.03 22.5 0.43±0.02* 0.52±0.02* 0.37±0.04 0.33±0.03 67.5 0.51±0.03** 0.59±0.03* 0.49±0.02* 0.42±0.02*60 nm SiO2組 7.5 0.30±0.04 0.41±0.02 0.36±0.02 0.33±0.04 22.5 0.41±0.04* 0.45±0.05 0.35±0.01 0.34±0.04 67.5 0.43±0.04* 0.55±0.03* 0.38±0.03 0.40±0.02*微米SiO2組 7.5 0.35±0.03 0.42±0.05 0.33±0.02 0.29±0.01 22.5 0.40±0.02* 0.45±0.02 0.34±0.04 0.30±0.05 67.5 0.43±0.03* 0.43±0.02 0.33±0.04 0.32±0.02

3 討論

目前，關于納米材料對生物機體所產生的生物學效應機制方面研究，主要關注的是納米物質的氧化應激和炎癥反應學說[6-7]。納米材料進入機體后引起生物體產生過量的活性氧(ROS)，導致氧化應激反應發生，從而產生炎癥反應及其他的毒性效應。但目前關于納米材料的氧化損傷方面研究，主要是集中在肺組織的氧化損傷研究，尚缺乏對肺外其他組織氧化損傷的系統研究。因此，本研究通過氣管灌注法將不同粒徑的納米SiO2和常規微米SiO2對實驗動物染毒，通過檢測肺、肝、心、睪丸組織的SOD和GSH-Px酶活性及TBARS水平改變，探討不同粒徑的納米SiO2和常規微米SiO2對肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用。

SOD是在機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的酶，SOD具有清除氧陰離子自由基和抑制脂質過氧化反應，保護細胞免受損傷的作用，GSH-Px是細胞內抗過氧化、保護肺泡巨噬細胞膜性系統的重要酶系，主要通過消除過氧化氫，保護組織細胞免受自由基的損傷。正常情況下，生物機體通過抗氧化酶，如SOD、GSH-Px等組成的防御系統抵抗自由基對生物機體的損傷[8]。SOD、GSH-Px活性降低和TBARS水平升高表明生物機體抗氧損傷化功能降低、脂質過氧化增強，生物機體可能受到一定程度的氧化損傷。

本研究結果表明，20 nm SiO2使肺臟、肝臟、心肌、睪丸組織的SOD、GSH-Px酶活性顯著降低及TBARS水平明顯升高(P＜0.05)，且在22.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2組的肺、肝組織SOD、GSH-Px酶活性也顯著低于對照組(P＜0.05)；60 nm SiO2均可引起肺、肝、睪丸組織的SOD和GSH-Px酶活性顯著降低及TBARS水平明顯升高(P＜0.05)；而微米SiO2只引起肺組織SOD、GSH-Px酶活性降低及TBARS水平明顯升高(P＜0.05)。這一結果表明納米SiO2對實驗大鼠肺、肝、心、睪丸組織均有不同程度的氧化損傷作用，其中對肺臟的損傷最大，肝臟次之，睪丸組織較小，心臟最小，且20 nm SiO2的毒性作用強于60 nm SiO2的毒性作用，而微米SiO2僅對肺組織產生較明顯的氧化損傷作用。這一結果也說明納米SiO2可以對生物機體肺、肝、心、睪丸等多個組織器官具有毒性作用，粒徑越小，且其毒性作用愈強，其毒性機制可能是通過破壞組織的氧化-抗氧化系統的平衡，對細胞膜產生脂質過氧化，導致氧化損傷所致。因此氧化應激引起的氧化損傷可能是納米SiO2毒性作用的機制之一。納米材料是具有納米尺度特殊理化性質的顆粒物質，其與機體的作用方式、作用途徑、作用機制是一個極其復雜的生物學過程，但具體機制還需進一步探討。本研究結果也表明，納米材料的潛在毒性作用可能是非常廣泛的、涉及多組織器官的損害，對此目前本實驗室正在進行研究中。

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