Osx基因活化技術促進種植體周圍骨再生的實驗研究

黃國倩，李大魯，李肇元

(濟南市口腔醫院，濟南250001)

經典的組織工程骨由種子細胞、成骨因子和支架材料組成，通過填充骨缺損、發揮骨傳導和骨誘導作用來完成骨的修復與重建。但是體外組織工程骨的構建步驟繁瑣，費用高，操作周期長，對患者損傷大;而且老年患者的骨髓間充質干細胞占骨髓細胞的比例相應減少，細胞增殖率下降且體內成骨能力明顯減低;同時外源性成骨因子在體內易流失和失去活性，作用持續時間短，效價低，成本高，可能會誘發機體免疫反應。2010年6月～2011年3月，我們通過基因技術將編碼與骨組織再生相關的生長因子基因片段轉移至種子細胞中，使種子細胞持續高效表達促骨生長因子，促進骨的形成。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:選用健康雄性12個月齡Beagle犬(山東省醫藥工業研究所提供，符合國際實驗動物要求)15只，體質量9～12 kg。犬均采用籠中獨立圈養的方法，定時、定量攝食，自由飲水，適應性飼養2周后進行實驗。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。主要藥品及器材設備:質粒pcDNA3.1 flag-Osx、大腸桿菌 E.coli DH5α 感受態、Biogide可吸收性膠原骨膜。

1.2 方法

1.2.1 質粒 pcDNA3.1flag-Osx的擴增 使用 Qiagen質粒大提試劑盒從大腸桿菌E.coli DH5α中純化提取質粒 pcDNA 3.1 flag-Osx。

1.2.2 動物實驗

1.2.2.1 術前準備 制備Osx基因活化材料倍骼生+凍干質粒，在無菌操作臺上將0.5 g倍骼生準備好，使用凍干機24 h凍干質粒備用，每個骨缺損處放置1.2 mg質粒。

1.2.2.2 手術過程 實驗犬下肢外側區域備皮，局部消毒后行靜脈注射戊巴比妥鈉溶液麻醉(戊巴比妥鈉與0.9%氯化鈉注射液配成濃度為1%～3%的溶液)，麻醉注射劑量為30 mg/kg;待麻醉起效后，將實驗犬臥位固定于手術臺上，開口器固定。每只動物拔除左側下頜第2前磨牙(標記為部位A)及右側下頜第2前磨牙(標記為部位B)，在拔牙創周做梯形切口，翻瓣，用超聲骨刀于拔牙創頰側制備頰舌向5 mm、近遠中向5 mm、垂直高度10 mm的骨缺損，分別植入直徑3.3 mm、長度13 mm的奧齒泰 GSII種植體，A處骨缺損區填入倍骼生+空載體pcDNA3.1flag(為A組);B處骨缺損區填入倍骼生+pcDNA3.1flag-Osx(為 B組)。應用GBR技術，在材料表面覆蓋Bio-gide膠原膜，嚴密縫合牙齦。

1.2.2.3 CT 掃描 分別于術后 4、8、12 周各處死5只動物，取含種植體近遠中向至少6 mm的下頜骨，包括頰舌側牙齦及軟組織，制備成約15 mm×6 mm×20 mm的組織塊。用生理鹽水沖洗標本，固定于4%甲醛48 h。將標本置于GE公司Explore Locus Micro-CT標本檢測臺上并牢固固定，注意保持種植體長軸與掃描室切面垂直，沿標本的長軸方向掃描，獲取連續的Micro-CT圖像。選定興趣區域(ROI)，CT值高于1 000定為骨組織。距離骨缺損上下緣2 mm，骨缺損左、右側1 mm處分別選定2 mm×1 mm×1 mm大小的組織2塊，記為ROI1、ROI2。進行掃描圖像的三維重建后，采用直接法和間接法計算評估。檢驗參數包括:骨小梁體積(BV)、骨體積分數(BVF)、骨小梁間隙(TbSp)、骨小梁厚度(TbTh)、骨小梁數目(TbN)、結構模型指數(SMI)。

1.2.3 統計學方法 應用 SPSS17.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較進行配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般情況 術后各觀察時期內實驗動物均健康存活，創口愈合良好，無炎癥反應，經術后3 d的抗生素肌注，術后1周炎癥反應基本消退予以拆除縫線。術區無感染、無生物膜暴露、無軟組織裂開等并發癥。

2.2 兩組CT掃描數據比較 兩組術后4、8、12周TbSp、TbTh 、TbN、SMI、BVF、BV 比較見表 1。

表1 兩組術后 4、8、12 周 TbSp、TbTh 、TbN、SMI 、BVF、BV 比較(±s)

表1 兩組術后 4、8、12 周 TbSp、TbTh 、TbN、SMI 、BVF、BV 比較(±s)

注:與A組同時間比較，aP＜0.05

組別 n TbSp(μm) TbTh(μm) TbN(個/mm) SMI BVF(%) BV(mm3)A 組術后4 周 5 12.06 ±0.12 0.37 ±0.33 0.47 ±0.13 2.05 ±0.14 0.31 ±0.10 6.32 ±0.51術后8 周 5 12.81 ±0.16 0.40 ±0.43 0.50 ±0.12 1.39 ±0.02 0.37 ±0.02 7.95 ±0.38術后12 周 5 11.96 ±0.43 0.44 ±0.23 0.60 ±0.79 1.66 ±0.23 0.41 ±0.05 8.90 ±0.65 B組術后4 周 5 12.87 ±0.20a 0.39 ±0.02 0.49 ±0.19a 2.09 ±0.06 0.32 ±0.02a 7.21 ±0.05a術后8 周 5 12.34 ±0.12a 0.43 ±0.42a 0.55 ±0.29a 2.01 ±0.32 0.38 ±0.53 8.67 ±0.20a術后12 周 5 12.64 ±0.37a 0.46 ±0.20a 0.67 ±0.35a 1.69 ±0.21a 0.47 ±0.48 9.78 ±0.79a

3 討論

3.1 Osx基因及其表達和調控 Osx［1］是近年發現的成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的轉錄因子，尤其在成骨細胞終末分化成熟過程中發揮重要作用。人Osx基因編碼產物為特異蛋白7(SP7)，是含有428個氨基酸的蛋白質，羧基末端有3個連續的Cys2-His2鋅脂結構，該鋅脂結構可與真核細胞啟動子結合調控基因的轉錄［2］。Bowman 等［3］比較了Osx基因和其他SP家族成員序列后發現，Osx具有一個獨立的蛋白序列谷氨酸轉導活化區，而且在鋅脂結構外有一個富含脯氨酸區域。脯氨酸富含區是BMP信號通路中重要的結合區，對成骨細胞的分化非常重要。有人認為Osx基因是核結合因子(Cbfal)的下游基因，Cbfal是成骨細胞分化最關鍵的作用因子。在Osx基因剔除小鼠胚胎中，成骨細胞的分化受到阻礙，各種成骨分化標志的表達水平也嚴重降低或缺如。其中骨鈣素作為一種高度特異性的晚期成骨細胞標志物的表達缺失，說明成骨細胞的分化、成熟被完全阻斷［4］。染色發現，Osx(-/-)小鼠胚胎中無礦化反應、完全喪失骨形成能力，新生的Osx(-/-)小鼠出生后即因呼吸困難死去。由此可見，Osx是成骨細胞分化和骨發育不可缺少的調節因子［5，6］。

3.2 基因活化技術 基因治療本質上是向細胞導入特異性的基因信號，合成和分泌一種基因產物(蛋白質)的過程［7］。干細胞在轉染成骨基因后，可以出現自分泌和旁分泌現象［8］。在這個過程中，細胞介導的生長因子合成與細胞本身的靶受體更加緊密地聯系在一起，增強了機體對基因治療的反應強度和持續性［9］。加上轉染的修飾作用，基因轉染的干細胞所分泌的生長因子可能具有更高的生物學活性。基因活化材料是專為組織工程設計的轉基因材料。基因活化技術是一種直接的基因轉移技術，也可以看成是組織工程概念的延伸。一個基因活化材料包含一個三維的轉基因載體和生物可降解結構基質［10］，載體作為一種保存原位 DNA的支架持續發揮作用至內源性的修復細胞到達。與載體聯合的攜帶編碼細胞因子和生長因子基因的DNA會表達所需要起治療作用的基因。當基因活化材料植入組織缺損區時，其中的DNA隨著材料的溶脹、降解而釋放出來，材料內的種子細胞或周邊組織細胞與釋放出來的基因成分結合，或黏附在材料表面，通過內吞方式獲取治療基因片段，表達、合成治療因子并作用于周圍細胞。這樣即可持續的使細胞因子少量表達，引起局部修復應答，以實現組織再生。

基因活化基質采用體內被動方式轉染基因，操作簡單，能節約費用和減少對患者的損傷，在促進局部組織尤其是骨組織損傷修復方面有明顯的優勢。種植體周圍骨缺損的修復是一個長期的過程，生長因子在局部長期表達有利于骨的重建，而且質粒DNA在血液中的高分解率使其不會造成全身中毒。這種直接將基因傳遞到靶細胞的方法在臨床應用的可能性很大，因此我們采用基因活化材料來修復犬種植體周圍的骨缺損，并觀察其療效。通過CT檢查發現［11］，本研究中Osx植入種植體頰側骨缺損處的A組與無Osx植入的B組比較，TbSp、TbN、BVF、BV均有統計學差異。顯示應用Osx基因激活基質可有效促進種植體頰側骨缺損處新骨的形成。目前應用基因治療促進種植體周圍新骨形成的研究尚少，本實驗結果可以為進一步研究Osx基因在臨床的應用打下基礎。

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