慢性脊髓壓迫減壓后脊髓缺血再灌注損傷的動物實驗研究

華 凱，郭慶升，張善勇

(遼寧省人民醫院，沈陽110016)

頸椎病、頸椎管狹窄癥、胸椎管狹窄癥、椎管內腫瘤等都會造成脊髓的慢性壓迫，進而導致脊髓功能嚴重受損，脊髓減壓是治療此類疾病最有效的方法。臨床中常遇到手術后脊髓壓迫癥狀短時間緩解后，隨即出現癥狀加重現象，目前考慮此種現象為脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)，會造成脊髓毀滅性的神經功能受損［1～4］。鑒于 SCIRI對患者的損害嚴重，對其損傷機制的研究顯得尤為重要。2011年5月～2012年5月，我們建立兔不同程度的頸髓壓迫模型，減壓后檢測脊髓內再灌注損傷標志物及凋亡神經元，以明確再灌注損傷與脊髓壓迫程度的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭白兔96只由吉林大學基礎實驗動物中心提供，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限。飼養條件要求室溫22℃，分籠飼養，自由進食。實驗動物的處理方法均符合國家科學技術部頒發《關于善待實驗動物的指導性意見》［5］。

1.2 方法

1.2.1 建立慢性脊髓壓迫模型 經兔耳緣靜脈采用戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉，使其自由呼吸，切口局部及周圍組織使用0.5%利多卡因注射局麻。經頸前方分離顯露頸5椎體，先使用手鉆在椎體上緩慢鉆孔，鉆透椎體后壁，然后在頸5椎體中央擰入一枚螺釘，透視顯示螺釘進入椎管內20%左右時停止。術中監測未發現脊髓誘發電位有明顯變化。沖洗術區后關閉創口。術后第1個月，每1周擰入螺釘0.25 mm。術后第2～4個月，每2周擰入0.25 mm。術后第5個月以后，每1個月擰入0.25 mm。

1.2.2 動物分組 96只動物隨機分為A、B、C、D 4組，每組24只。A組:假手術組，頸5椎體上鉆孔后即關閉創口，不擰入螺釘。B組:椎管螺釘占位達50%時停止擰入，繼續飼養1個月。C組:椎管內螺釘占位達60%時停止擰入，繼續飼養1個月。D組:椎管內螺釘占位達70%時停止擰入，并繼續飼養1個月。根據脊髓組織取材時間不同以上每組又分為2 個亞組(A1、A2 組，B1、B2 組，C1、C2 組，D1、D2組)，每組12只。使用改良 Tarlov評分系統［6］對各組實驗動物處死前評分，由一人單盲完成。

1.2.3 組織取材 A1、B1、C1、D1組動物均給予致死量的戊巴比妥鈉(200 mg/kg)，迅速取出頸5椎體所對應的脊髓節段。將中央部分切除經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，剩余組織使用液氮轉存于-80℃冰箱。A2、B2、C2、D2組耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(25 mg/kg)，自由呼吸，切口局部及周圍組織使用0.5%利多卡因注射局麻。A2組僅顯露頸5椎體后關閉創口。B2、C2、D2組顯露并迅速取出螺釘，關創。6 h后所有動物給予致死量的戊巴比妥鈉(200 mg/kg)，迅速取出頸5椎體所對應的脊髓節段，將中央部分切除經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋。剩余組織使用液氮轉存于-80℃冰箱。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)及超氧化物激酶(SOD)活性測定 組織勻漿后采用超聲細胞破碎儀破碎細胞，按1∶9配制成10%組織勻漿，勻漿介質為冰生理鹽水。10 000 g離心15 min，取上清凍存于-80℃備測。SOD、GSH-px活性及MDA含量測定參照南京建成生物工程公司提供的測試和說明進行。

1.2.5 TUNEL凋亡染色 TUNEL試劑盒購自北京博奧深生物技術有限公司。石蠟切片厚度為4 μm，按說明書操作封片后熒光顯微鏡下觀察，每只實驗動物取3張切片，計算脊髓前角第Ⅷ、第Ⅸ板層TUNEL染色陽性神經元數目，由1名病理醫師單盲觀察，結果取3張切片計數的平均值。

1.2.6 統計學方法 采用 SPSS15.0統計軟件，數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，多組間兩兩比較采用SNK(Stundent-Newmall-Keuls)檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠處死前神經功能評分 Tarlov評分A1、B1、C1、D1 組分別為(4.00 ± 0.00)、(3.08 ±0.44)、(2.33 ± 0.61)、(1.58 ± 0.27)分，A2、B2、C2、D2組分別為(4.00 ± 0.00)、(3.66 ± 0.24)、(2.91 ±0.08)、(1.75 ±0.20)分。A 組 Tarlov評分顯著高于B組、C組和D組(P均＜0.05)。B1、C1、D1組Tarlov評分依次減低，組間有統計學差異(P均＜0.05)。B2、C2組 Tarlov評分高于 B1、C1組，組間有統計學差異(P均＜0.05)。

2.2 各組大鼠脊髓組織中MDA含量及GSH-px、SOD活性 見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中MDA含量及SOD、GSH-px活性比較(±s)

表1 各組大鼠脊髓組織中MDA含量及SOD、GSH-px活性比較(±s)

注:與 A1組比較，aP ＜0.05;與 D1組比較，bP ＜0.01

組別 n M D A(n m o l/m g) S O D(U/m g) G S H-p x(U/m g)A 1組1 2 4.0 1 ±0.5 3 1 0 1.1 2 ±1 2.1 7 1 2.1 1 ±1.2 8 A 2 組 1 2 4.2 3 ±0.9 8 1 1 2.5 2 ± 9.8 2 1 3.5 2 ±2.0 1 B 1 組 1 2 5.4 3 ±0.3 7 a 9 0.3 5 ± 6.4 5 a 1 1.2 1 ±0.9 8 a B 2 組 1 2 5.6 9 ±1.0 8 8 8.2 9 ± 5.3 3 1 0.5 7 ±1.2 0 C 1 組 1 2 6.2 2 ±0.7 8 a 8 1.1 8 ± 4.3 8 a 9.4 8 ±0.8 7 a C 2 組 1 2 6.3 2 ±1.1 8 7 5.2 7 ± 5.5 7 8.9 3 ±0.7 1 D 1 組 1 2 6.5 1 ±0.5 6 a 7 8.4 5 ± 4.9 0 a 6.5 5 ±0.4 5 a D 2 組 1 2 8.9 1 ±1.5 2 b 6 1.2 3 ± 3.8 8 b 3.8 6 ±0.6 2 b

2.3 凋亡神經元計數 A1組、A2組未見TUNEL染色陽性神經元;與A1組相比，B1、C1、D1組陽性細胞數目逐漸增加，各組之間均有統計學差異(P均＜0.05)。A1 與 A2、B1 與 B2、C1 與 C2、D1 與 D2組比較無統計學差異(P均＞0.05)。見圖1。

3 討論

圖1 各組TUNEL染色陽性神經元計數

脊髓受壓后缺血缺氧，常導致脊髓神經細胞死亡或凋亡［7，8］。手術解除壓迫是治療脊髓壓迫性疾病最直接也是最重要的方法。Nassr等［3］報道的連續750例多節段脊髓受壓的頸椎病，減壓手術后6.7%的患者出現了單個或多個神經根麻痹的現象，其中19%轉變成永久性損害。脊髓長時間受到壓迫，處于慢性缺血缺氧狀態，而減壓對于慢性受壓脊髓是一種瞬時改變，減壓術后即可見脊髓搏動，脊髓血液灌注相對于減壓前迅速增加。目前認為脊柱減壓手術后SCIRI是癥狀加重的主要原因。

本實驗中通過建立脊髓慢性壓迫模型發現，當螺釘在椎管內占位達到50%時出現輕微的行為學改變，隨著螺釘的不斷進入，實驗動物的脊髓受壓癥狀迅速加重。當椎管內占位達到60%以后，即使輕微的增加螺釘的進入即可明顯地加重脊髓損傷癥狀，這與既往研究結果基本一致［9～11］。螺釘取出后，椎管內占位達50%和60%的實驗動物神經功能明顯恢復，而椎管內占位達70%的實驗動物神經功能恢復不明顯，其中1只動物出現螺釘取出后神經功能惡化的現象。這與臨床上發現的脊髓減壓后神經功能惡化發生于脊髓壓迫嚴重的患者相一致［12］。

脊髓中脂質含量豐富，更易受到活性氧的攻擊。壓迫導致缺血使神經細胞線粒體氧化還原酶系脫耦聯，產生大量氧自由基，后者易攻擊脂質引發過氧化反應，MDA是脂質過氧化的最終產物，測定MDA可直接反映自由基水平，反映SCIRI的程度［13］。SOD除通過催化O-2歧化反應，發揮抗氧自由基外，還可增強H2O2濃度的調節功能保護組織細胞，能抵御自由基對細胞的破壞，保持細胞膜的完整性，SOD活性可反映機體對氧自由基清除能力的高低。GSH-Px能夠減少氧化反應中羥基產生，是脊髓組織中清除過氧化物的重要酶類。本研究中，脊髓組織中MDA含量隨著脊髓壓迫程度的增加而增加。說明隨著脊髓壓迫程度的增加，產生脊髓循環障礙，微血管栓塞，神經元線粒體功能障礙，線粒體氧化還原酶系脫耦聯，產生過多氧自由基，后者易攻擊脂質引發過氧化反應。當解除螺釘壓迫后，MDA含量較之前有不同程度的提高，且提高程度與壓迫水平呈正相關。當螺釘在椎管內占位達到椎管徑線的70%時，減壓后脊髓中MDA增高顯著，與減壓前比較有統計學差異。反映減壓后脊髓供血供氧突然增加，通過多種途徑使氧自由基迅速增加，使脂質過氧化，MDA產生過多。MDA在各組中的變化說明了慢性脊髓壓迫減壓后SCIRI的存在，而且其損傷程度隨壓迫程度增加而增加。

本實驗中凋亡神經元隨脊髓壓迫程度加重而增多，而減壓前和減壓后比較，凋亡神經元數量無差異，考慮可能與減壓后觀察時間過短有關。

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