胃癌組織GSTP1第5外顯子基因型檢測及其與臨床病理特征的關系

王旭光，張 忠，王 瑩，張 珉，韓 瑩，潘曉蔚

(沈陽醫學院，沈陽110034)

研究發現，遺傳易感基因的存在增加胃癌的發病風險，特別是負責體內解毒和修復DNA的基因。谷胱甘肽轉移酶類(GSTs)是機體內重要的Ⅱ相解毒酶，π類GSTs(GSTP1)是其中之一。有研究顯示，GSTP1不同基因型與乳腺癌、口腔癌、結腸癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤有關［1～3］。前期研究顯示，GSTP1第5外顯子不同基因型與胃癌發生前腸化生階段有關，在腸化生階段與幽門螺桿菌的感染存在著正交互作用［4，5］。但上述結果基于血清學研究，在組織學中該位點的不同基因型是否與胃癌有關，尚需要進一步研究。本研究檢測胃癌組織中GSTP1第5外顯子基因型，探討其與胃癌臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年3月～2012年12月中國醫科大學附屬第一醫院、沈陽奉天醫院和沈陽第四人民醫院收治經病理確診的胃癌患者216例(胃癌組)，男163例，女53例;年齡28～87歲，平均61.1歲。另選良性胃疾病患者300例作為對照組，包括中度慢性胃炎100例、重度慢性胃炎106例、萎縮性胃炎94例，其中男227例，女63例;年齡30～85歲，平均60.8歲。兩組年齡、性別均具有可比性(P均 ＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 對照組分別于患者的胃竇、胃角和胃體部胃鏡取活檢組織，胃癌組為術后標本(取材部位同對照組)，經95%乙醛或10%中性甲醛固定，石蠟包埋制作切片。每例標本連續切10～12片，每片厚 5 μm。

1.2.2 GSTP1第5外顯子基因型檢測 采用PCRRFLP法。采用FFPE石蠟標本DNA提取試劑盒提取DNA，進行PCR擴增;上游引物5'-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3'，下游引物5'-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3';擴增條件:95 ℃ 12 min，95 ℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，15個循環;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25 個循環;72 ℃ 5 min;16 ℃ 保存［4］。取 PCR 產物 2 μL，加限制性內切酶 Alw26I 2 μL、NET緩沖液4 μL及去離子水配成20 μL體系，在37℃恒溫箱中酶切3 h，2%瓊脂糖凝膠進行電泳，EB顯色10 min后觀察DNA條帶。依據文獻［6］分析胃癌的不同病理特征與GSTP1基因型的關系。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。各組基因型的比較采用χ2檢驗;GSTP1基因型與胃癌臨床病理特征的關系分析采用非條件Logistic回歸分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSTP1第5外顯子基因型檢測結果 經限制性內切酶Alw26I酶切電泳后，GSTP1呈現3個不同條帶，具有329 bp和107/104 bp的為野生純合型AA，具有329 bp、222 bp和107/104 bp 3個條帶的為雜合突變型AG，具有222 bp和107/104 bp兩條帶為純合突變型GG。見圖1。

圖1 GSTP1第5外顯子不同基因型電泳圖

2.2 兩組GSTP1第5外顯子不同基因型比較 胃癌組AA基因型163例(75.5%)，AG基因型43例(19.9%)，GG 基因型10例(4.6%);對照組 AA 基因型248例(82.7%)，AG基因型45例(15%)，GG基因型7例(2.3%);胃癌組 AG+GG基因型比例為24.5%，高于對照組的17.3%(P ＜0.05)。

2.3 GSTP1第5外顯子基因型與胃癌臨床病理特征的關系 胃癌組AG+GG基因型比例在高分化組低于中、低分化組，在腸型胃癌組織中低于彌漫型胃癌組織，在＞50歲人群中的比例高于≤50歲人群，P均＜0.05;而性別、大體分型、腫瘤直徑、浸潤深度和淋巴結均與基因型無關(P均＞0.05)。見表 1、2。

3 討論

據2012年統計，我國胃癌發病率為36.21/10萬［7］。胃癌的發生與外界環境因素和內在遺傳因素密切相關。近年來，人們在研究環境致胃癌的基礎上，更關注其內在的遺傳特性(即遺傳易感性)。研究發現，許多基因的變異與胃癌的關系密切，包括細胞增殖、凋亡及相關調控基因(Cyclin D1、Fas等)、修復基因(XRCC1等)、癌基因和抑癌基因(Ras、p53 等)、黏蛋白及黏附分子基因(MUC1、E-cadherin等)及細胞因子基因(IL-1β、IL-10、IL-8 等)的變異，特別是具有解毒功能的代謝酶基因(CYP2E1、GSTT1、COX-2 等)［8～12］。

表1 GSTP1基因型與胃癌臨床病理特征的關系［例(%)］

表2 GSTP1基因型與胃癌分化程度和Lauren分型關系的分層分析結果

GSTs在1961年由Booth首先發現，可分為兩類:一類是膜結合型家族，以微粒體為代表;另一類是細胞型家族，包含 6種，即 α(GSTA1～GSTA4)、μ(GSTM1～ GSTM5)、π (GSTP1)、θ(GSTT1 和GSTT2)、ζ(GSTZ1)和 ω［13］。編碼這些基因的多態性決定著這些酶的功能，特別是GSTP1基因第5外顯子1 587對堿基處A→G，導致異亮氨酸(Ile)-105→纈氨酸(Val)，從而使其氨基酸的體積和疏水性發生改變，影響其熱穩定性，降低解毒功能。

GSTP1基因是代謝酶基因中的一種，就該基因變異與胃癌關系的研究結果顯示，胃癌組AG+GG基因型的比例高于對照組，提示G等位基因的突變是胃癌發生的原因之一。其機制可能為GSTP1基因發生突變后，熱穩定性發生改變，進而影響其功能，導致人體解毒功能不足，大量毒物進入體內，最終可能進一步導致其他基因變化，進而發生胃癌。有研究顯示，生理狀態下GSTP1所編碼的蛋白質(GSTP-pi)是以二聚體形式存在，并和C-JUN、JNK相結合形成復合物，當有毒物入侵時，GSTP-pi從復合物中解離，發揮解毒功能，同時釋放 C-JUN和JNK［14］。C-JUN和JNK是與腫瘤發生密切相關的基因，是否二者的激活進一步導致胃癌的發生，尚需深入研究。

本研究結果顯示，GSTP1第5外顯子基因型變異與胃癌患者性別及胃癌直徑、大體分型、浸潤深度、淋巴結轉移等因素無關。而＞50歲胃癌患者AG+GG基因型比例高于≤50歲者，提示＞50歲的GSTP1第5外顯子基因型變異者可能更易發生胃癌。胃癌的發生是致癌因素長期累積的結果，GSTP1基因變異，使這些致癌物更易累積，特別是＞50歲的人群，機體無法對抗其制毒作用，導致胃腺體更易發生癌變。高分化組AG+GG基因型比例低于中、低分化組，提示GSTP1突變的個體更易發生分化較低的胃癌。前期免疫組織化學結果顯示，在高分化胃癌組織中GSTP-pi表達高于中、低分化胃癌，特別是在低分化胃癌中GSTP-pi幾乎不表達，推測GSTP1突變可能導致其蛋白表達和解毒能力降低，使胃癌去分化現象更加顯著，惡性度更高。Lauren分型結果顯示，腸型胃癌患者AG+GG基因型的比例低于彌漫型胃癌，提示GSTP1變異增加彌漫型胃癌的發病風險。

總之，GSTP1第5外顯子AG和GG基因型與胃癌患者年齡、胃癌的組織分化程度及Lauren分型有關，而與患者性別和胃癌大體分型、癌腫直徑、浸潤深度、淋巴結是否有轉移等無關。從GSTP1第5外顯子基因型突變為切入點，進一步分析其上游和下游的調控因子的變化，有望找出胃癌內在的發病因素和機制。

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