芍藥苷預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞凋亡及CHOP蛋白表達的影響

毛森林，馬翊竑，張海東，齊 軍，李 峰

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150086)

腦缺血/再灌注損傷(CIR)最終會導致神經元 凋亡［1］，凋亡的通路主要有死亡受體活化途徑(外源性途徑)、線粒體損傷途徑(內源性途徑)和內質網應激啟動的凋亡途徑，其中內質網應激途徑(ERS)是目前發現的一種新的凋亡途徑［2，3］。有研究顯示，ERS在CIR過程中處于核心地位，預處理可以減輕組織損傷［4，5］，而上調 CHOP 蛋白表達是ERS誘導細胞神經元凋亡的途徑之一。有研究報道，芍藥苷(PA)不僅具有降低血黏度、抗血小板聚集、抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等作用［6～9］，還對 CIR有一定的保護功能［10］。2014年1～3月，我們觀察了PA預處理對CIR大鼠組織細胞凋亡及CHOP蛋白表達的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠72只，體質量(250±10)g，均來自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心。水合氯醛購于 Sigma公司，DMSO購于美國Amresco公司，冰凍切片快速抗原修復液購于碧云天生物技術研究所，DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于德國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 分組預處理與造模 將72只SD雄性大鼠隨機分為預處理組、模型組、假手術組各24只。預處理組給予0.2 mg/kg PA灌胃，模型組及假手術組給予等量PBS灌胃，1次/d，連續3 d。于給藥后第4天，參照Longa等［11］的方法并加以改良，建立大鼠CIA模型。造模前禁食12 h，不禁水。預處理組、模型組根據體質量腹腔注射水合氯醛0.3 mL/100 g，固定、備皮;后頸前正中旁開2 mm做縱行小切口，分離左側頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)及頸總動脈(CCA)。結扎ECA遠端，分別在ICA及CCA上放置顯微血管夾，在ECA距CCA分叉部約7 mm處剪一斜行小切口，將線栓自ECA切口插入;用電凝器將剪口處電凝處理，切斷ECA，分別松開ICA及CCA上顯微動脈夾;調轉線栓頭端方向，將線栓在直視下插入ICA約17 mm，從而阻斷大腦中動脈(MCA)主干血流;將大鼠切口處用紗布蘸取少量生理鹽水覆蓋，保留線栓90 min后拔出，縫合切口。假手術組僅暴露各動脈，不做切口與線栓插入。在模型制作過程中，凡手術中動物死亡、蛛網膜下腔出血或無對側偏癱體征均視為模型制作失敗，用同一批次的大鼠造模成功后補足數目。

1.2.2 腦組織細胞凋亡檢測 采用TUNEL法。各組分別于再灌注1(T0)、4(T1)、24(T2)h各取6只大鼠快速斷頭取腦，制作腦組織冰凍切片，片厚7 μm。4%多聚甲醛固定，PBS洗滌、孵育，加50 μL生物素標記液，37℃孵育60 min;加0.1～0.3 mL標記反應終止液，室溫孵育10 min;加50 μL Streptavidin-HRP工作液，濕盒室溫孵育30 min;加0.2～0.5 mL DAB顯色液，室溫孵育;常規乙醇脫水，二甲苯透明后封片。細胞核或細胞質染成棕黃色顆粒者為陽性細胞，即為凋亡細胞。于200倍顯微鏡下隨機選取6個視野，每個視野采用IPP6.0軟件計數凋亡細胞。細胞凋亡指數=凋亡細胞/細胞總數×100%，取平均值。

1.2.3 腦組織CHOP蛋白檢測 采用免疫組化法。切片經4%PFA固定20 min，30%H2O2和純甲醇以1∶50的比例固定30 min，抗原修復液修復5 min，5%BSA封閉 30 min。加 CHOP抗體(兔 IgG 1∶100)4℃過夜，及生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)37℃孵育20 min。SABC封閉30 min后DAB顯色，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片。以PBS代替CHOP抗體作為對照，細胞核及細胞質呈棕黃色為陽性表達。顯微鏡下每張切片隨機選取6個視野進行觀察拍照，使用IPP6.0軟件進行細胞計數。CHOP蛋白表達=陽性細胞數/細胞總數×100%。1.2.4 神經功能評分 每組于缺血再灌注后24 h各取6只大鼠，由不知分組情況的觀察者在相同條件下參照Bederson等［12］的方法進行神經功能評分:0分:正常，未見任何神經功能缺損表現;1分:垂直提起時缺血對側前爪不能伸直;2分:行走時向偏癱側轉圈;3分:行走時身體向偏癱側傾倒;4分:不能自發行走或有意識障礙。評分為0、4分者剔除實驗。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組內比較采用配對t檢驗，組間數據比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦組織細胞凋亡指數和CHOP蛋白表達比較 見表1。

2.2 各組神經功能評分比較 預處理組神經功能評分為(1.33 ±0.52)分，模型組(2.50 ±1.05)分，假手術組為0分;預處理組和模型組的神經功能評分均高于與假手術組，P分別 ＜0.05、0.01;預處理組和模型組比較，P ＜0.01。

3 討論

缺血性腦卒中是由各種原因所致急性腦動脈血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性壞死，出現相應神經功能損害的綜合征［13］;是嚴重威脅人類健康的疾病之一，具有高發病率、高致殘率、高復發率的特點。正常生理狀態下，流經腦組織的血液為750～1 000 mL/min，為心臟每搏輸出量的1/5，腦組織耗氧量占全身耗氧量的20%～30%，腦細胞的主要能量來源為有氧代謝產生的葡萄糖，幾乎沒有能量儲備，因此腦組織對缺血、缺氧性損害十分敏感。如果腦動脈血流持續中斷10～15 min，神經元就會發生不可逆性損害而壞死［14］。因此，在CIR超急性期采取積極的治療措施恢復血供尤為重要。溶栓治療可以實現閉塞腦動脈再通，重建腦血流，使受損腦組織的血液重新再灌注，從而挽救缺血半暗帶，迅速恢復受損傷的神經功能，被認為是最有效的腦卒中治療方法［15］。而溶栓治療除有出血的并發癥外，再灌注損傷對腦細胞的損害也不可忽視。

表1 各組腦組織細胞凋亡指數和CHOP蛋白表達比較(%，±s)

表1 各組腦組織細胞凋亡指數和CHOP蛋白表達比較(%，±s)

注:與假手術組同時點比較，*P＜0.01;與模型組同時點比較，#P ＜0.05;與同組T0時點比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與同組 T1時比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01

組別 細胞凋亡指數 CHOP蛋白0.3 ±0.2預處理組T0 4.1 ±0.3*# 3.7 ±0.8*#T1 5.2 ±1.2*# 4.2 ±1.3*#T2 18.5 ±4.3*#△△☆☆ 12.7 ±1.2*#△☆模型組T0 9.3 ±0.2* 9.8 ±2.1*T1 10.6 ±2.5* 11.3 ±1.2*T2 29.5 ±2.6＊△△☆☆ 27.3 ±1.4＊△△☆假手術組T0 0 0.2 ±0.1 T1 0 0.2 ±0.1 T20

ERS主要通過以下3種方式誘導細胞神經元凋亡:①CHOP基因激活ATF4轉錄因子持續表達促使編碼細胞凋亡的誘導因子，上調 CHOP表達;CHOP可誘導氧自由基，促使細胞凋亡。②JNK激活途徑激活JNK誘導細胞凋亡。③ Caspase-12激活通路激活IRE后，激活Caspase-9、Caspase-3導致細胞凋亡。本研究采用PA對CIR大鼠進行預處理后發現，同時點腦組織細胞凋亡指數、CHOP蛋白表達比較，模型組 ＞預處理組 ＞假手術組，P均 ＜0.05;預處理組和模型組腦組織細胞凋亡指數、CHOP蛋白表達在缺血再灌注初期表達量很少，均于再灌注24 h達到峰值;且預處理組和模型組的神經功能評分均高于對照組。不僅說明缺血再灌注過程中CHOP蛋白表達的上調啟動了ERS，還證明了PA對于CIR大鼠的神經細胞具有保護作用，可以拮抗CHOP的表達，維持細胞的穩態，阻斷ERS誘導的細胞凋亡，進而減輕神經細胞的凋亡。

綜上所述，PA預處理可以顯著降低CIR大鼠腦組織細胞凋亡、CHOP蛋白表達及神經功能評分，可能與阻斷ERS引發的細胞凋亡有關。但是由于CIR機制很復雜，有諸多的環節共同作用，而且本研究以大鼠作為研究對象，和人體有很大的差異，所以PA預處理是否能在臨床上具有相同的效果仍有待于進一步研究。

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