大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中血流動力學及炎癥因子的表達變化

郭志祥，汪 歡，張成鑫，葛圣林

（安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥 230022）

急性心肌梗死（AMI）最有效的治療方法是盡早行再灌注治療［1，2］，但再灌注損傷是無法避免的問題。心肌缺血時，新陳代謝障礙，從而繼發一系列功能障礙;但當缺血心肌組織血流恢復后，會出現組織細胞損傷加重的病理狀態，導致心肌功能障礙或心律失常，稱為心肌缺血再灌注損傷［3］。炎癥因子是參與心肌缺血再灌注損傷的一個重要因素［4，5］。2013年10月～2014年4月，我們建立了大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察再灌注后血流動力學變化，及心肌組織與不同時段血清炎癥因子白細胞介素1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達變化。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠30只（香港大學實驗動物中心提供），體質量250～300 g。MODEL 683動物呼吸機（Harvard公司，美國），PowerLab Systems心電記錄儀（AD 公司，澳大利亞），IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購自美國Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將30只大鼠隨機分為 A、B組各15只，A組制備心肌缺血再灌注損傷模型:大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉75 mg/kg麻醉，經口氣管插管，接呼吸機機械通氣（吸入氣體為室內空氣混入0.5 L/min氧氣），設置潮氣量2～3 mL/100 g，通氣頻率60～80次/min，吸呼比1∶1，維持PETCO230～40 mmHg。行右頸總動脈切開置管，接壓力換能器，連接心電記錄儀記錄心電圖（ECG）、平均血壓（MAP）、心率（HR）;右側頸內靜脈穿刺置管，用于采集血樣及給藥。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在4、5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸廓，擠出心臟，用6-0 PROLENE縫線作一線結，在左冠狀動脈前降支下穿過，穩定10 min后拉緊結扎線30 min，造成局部心肌缺血。表現為左冠狀動脈所支配的局部心肌出現發紺，血壓下降，ECG出現心肌梗死改變（如ST-T升高或壓低等）。松開結扎線后，抬高ST段可相對降低（＞50%），血壓恢復，且缺血區心外膜顏色恢復紅潤作為再灌注成功的標準［6］。B組僅在左冠狀動脈前降支下穿線不結扎。

1.2.2 血流動力學觀察 缺血前即刻、缺血30 min及再灌注 30、60、120 min 時記錄 HR、MAP，并計算心肌氧耗指數（RPP為HR和MAP的乘積）。

1.2.3 血清炎癥因子檢測 分別于上述時點采集血清標本，ELISA 法檢測血清 IL-1、IL-6、TNF-α，按試劑盒說明書操作。

1.2.4 心肌組織炎癥因子檢測 采集完血樣，A組再次結扎左冠狀動脈前降支，取前降支結扎線下2 mm至心尖部左心室缺血心肌組織100 mg;搗碎組織，按1 mg/L加入含蛋白酶抑制劑與細胞裂解液的混合物4℃過夜;以20 000 r/min離心20 min，取上清于-80℃保存待測。B組在心臟同樣部位穿線但不結扎，于相同時間點采用相同方法采集標本。操作過程同血清內細胞因子檢測，同時用考馬斯亮藍蛋白測定法檢測每個組織標本的蛋白含量，得出數值后，將勻漿液中的細胞因子含量（mL）換算成蛋白中的細胞因子含量（mg）。

1.2.5 心肌組織學觀察 取部分心肌組織固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色壓片;顯微鏡下觀察心臟病理形態以及炎癥細胞分布情況，由同一個觀察者按照單盲的原則評估。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組各時點血流動力學變化 見表1。

2.2 兩組各時點血清 IL-1、IL-6、TNF-α 比較 見表2。

2.3 兩組心肌組織 IL-1、IL-6、TNF-α 表達比較見表3。

2.4 兩組心肌組織病理表現 A組可見心肌組織紋理紊亂，細胞核不規則，并出現大量炎癥細胞浸潤;B組可見心肌細胞排列整齊，組織紋理清晰，無明顯炎性細胞浸潤。

表1 兩組大鼠各時點血液動力學變化（±s，n=15）

表1 兩組大鼠各時點血液動力學變化（±s，n=15）

注:與同組缺血前即刻比較，*P＜0.05;與B組同時點比較，#P ＜0.05

組別HR（次/min）MAP（mmHg）RPP［×103，（mmHg·次）/min］A 組缺血前即刻 353±18 124±15 56±8缺血30 min 359±21 126±13# 47±6*再灌注30 min 360±21 109±16*# 43±7*#再灌注60 min 355±19 100±13*# 40±5*#再灌注120 min 352±20 91±9*# 40±5*#B組缺血前即刻 345±16 129±16 51±7缺血30 min 351±19 135±14 52±8再灌注30 min 356±23 123±17 52±8再灌注60 min 352±17 118±15 49±7再灌注120 min 347±18 110±13 47±7

表2 兩組大鼠各時點血清IL-1、IL-6、TNF-α比較（ ±s，n=15）

表2 兩組大鼠各時點血清IL-1、IL-6、TNF-α比較（ ±s，n=15）

注:與同組缺血前即刻比較，*P＜0.05;與B組同時點比較，#P＜0.05

組別IL-1（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（×103，pg/mL）A 組缺血前即刻 146±18 283±41 1.53±0.26缺血30 min 198±28*# 398±28*# 1.92±0.32*#再灌注30 min 255±28*# 521±37*# 2.22±0.34*#再灌注60 min 367±30*# 567±42*# 3.83±0.42*#再灌注120 min 418±24*# 592±40*# 4.11±0.48*#B組缺血前即刻 143±17 277±38 1.46±0.13缺血30 min 144±18 284±40 1.49±0.21再灌注30 min 151±15 279±44 1.50±0.18再灌注60 min 145±21 282±39 1.52±0.24再灌注120 min 142 ±8 276 ±42 1.55 ±0.28

表3 兩組大鼠心肌組織中IL-1、IL-6、TNF-α表達比較（pg/mg， ±s，n=15）

表3 兩組大鼠心肌組織中IL-1、IL-6、TNF-α表達比較（pg/mg， ±s，n=15）

注:與 B 組比較，*P ＜0.05

組別 IL-1 IL-6 TNF-α A 組 33.15 ±3.63* 36.72 ±3.45* 9.23 ±0.93*B組14.20 ±1.83 16.26 ±2.40 5.26 ±1.01

3 討論

1960年Jennings等［7］首次描述了心肌缺血再灌注損傷這一現象，隨后該現象引起了人們的廣泛關注。缺血再灌注損傷指在缺血基礎上恢復血流供應后組織損傷反而加重，甚至發生不可逆性損傷的現象［8］，心肌組織中可表現為心肌的舒縮功能降低、心律失常、心肌頓抑、微循環障礙等，其中一些表現為可逆性［9］。目前，關于炎癥因子在缺血再灌注損傷中的作用研究較廣泛，且研究結論富有爭議。大多數動物實驗表明，在心肌缺血再灌注過程中，促炎因子表達升高，且兩者具有一定相關性;但在臨床工作中，對于心肌缺血再灌注損傷的高危患者應用細胞因子抑制劑治療時卻收效甚微［10］。

本實驗主要研究了大鼠心肌缺血再灌注早期的血流動力學變化和炎癥因子在血清及心肌中的表達情況。本研究顯示，在大鼠心肌缺血再灌注損傷早期，心肌舒縮功能受到抑制，且呈逐漸加重趨勢，大鼠血清 IL-1、IL-6、TNF-α 水平持續升高，缺血區域心肌的炎癥因子表達較前亦有顯著增高。原因可能為缺血再灌注作為一種應激刺激，導致促炎癥細胞因子的活化，黏附分子的表達及中性粒細胞浸潤、細胞因子大量產生;另外，心肌舒縮功能受到抑制時灌注壓降低、腎濾過率下降可導致某些炎癥因子的清除減緩，從而引起血清中炎癥因子水平升高。

已有研究表明，心肌缺血再灌注損傷發生時，激活的補體能夠刺激肥大細胞，釋放出TNF-α。作為一種炎性細胞介質，TNF-α可直接損傷血管內皮細胞、激活中性粒細胞釋放氧自由基和彈性蛋白酶等，在體外循環中參與自身組織的破壞、內皮損傷等過程。其是機體受到應激刺激后最初分泌的細胞因子，可誘導其他多種因子的產生，如IL-1。IL-1在血漿和組織液中的主要形式為IL-1β，能夠協同其他細胞因子共同促進B、T細胞活化，且能誘導其他炎性介質的產生，加強白細胞與內皮細胞的黏附，調節IL-6、TNF-α生成，激活細胞因子級聯反應，促進氧自由基產生、活化中性粒細胞、誘導心肌細胞凋亡等，加重心肌缺血再灌注損傷［11］。Legendre 等［12］研究表明，缺血再灌注可誘導心肌細胞產生IL-6。IL-6處于炎癥反應調控的樞紐位置，具有免疫調節作用，可刺激中性粒細胞、心肌細胞表面分別表達CD11b/CD18及細胞間黏附分子-1（ICAM-1），介導其與心肌細胞結合，從而損傷心肌。近期的基因功能染色體分析顯示，IL-6信號通路也參與了局部炎癥的遠隔效應［13］。IL-6基因敲除的急性腎損傷小鼠，其遠隔器官肺損傷有所減輕、炎癥因子的表達亦降低。促炎因子不僅能夠引起心肌收縮力減弱，同時還促使心肌細胞肥大、誘導心肌細胞表達胚胎型蛋白、促進細胞凋亡。由此可見，3種促炎因子互相作用，產生級聯反應，激活成纖維細胞，誘導心肌間質纖維化，促進氧自由基及溶酶體酶的釋放，進而損傷心肌;破壞凝血平衡，促進微血栓形成，阻塞心肌供血的小血管，加重缺血再灌注損傷，進一步促使促炎因子生成，產生惡性循環。有學者稱，急性心肌梗死后的一段時間內，會出現多種炎性細胞因子大量表達，而炎性因子的表達水平增高與患者心臟舒縮功能的減退直接相關。因此，在急性心肌梗死的早期干預治療過程中，尤其是在缺血再灌注損傷的保護機制中，炎性胞因子起著明顯的負面作用。若能夠抑制急性心肌梗死后炎癥細胞因子的表達，則可以延緩心室重塑過程，保護心臟相關功能。

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