瘦素對(duì)快速動(dòng)眼睡眠剝奪大鼠焦慮行為的影響及其機(jī)制探討

馬文彬，韓笑峰，鄭 麒，陳 芳，李希芝，葛汝麗

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603）

研究發(fā)現(xiàn)，快速動(dòng)眼（REM）睡眠剝奪與大鼠焦慮行為的變化呈時(shí)間相關(guān)性［1］。短期REM睡眠剝奪對(duì)大鼠焦慮行為無(wú)明顯影響，長(zhǎng)期REM睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠焦慮行為顯著減少，而瘦素可消除長(zhǎng)期REM睡眠剝奪導(dǎo)致的大鼠焦慮行為減少。因此，瘦素可能參與REM睡眠剝奪的抗焦慮作用。2012年1月～2013年12月，我們觀察了瘦素對(duì)REM睡眠剝奪大鼠焦慮行為的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性封閉群Wistar大鼠90只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（160 ±10）g。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理方法 采用隨機(jī)數(shù)字分布表法將大鼠分為3組，每組30只，分別為L(zhǎng)-SD組、NS-SD組、NS組，根據(jù)處理時(shí)間不同每組再分為3個(gè)亞組各10只。NS-SD組、L-SD組置入REM睡眠剝奪小平臺(tái)中，使其始終不能進(jìn)入REM睡眠期［2］，分別于睡眠剝奪24、72、120 h腹腔注射生理鹽水2 mL/d、瘦素200 μg/d（2 mL/d）;NS 組分別于正常群居24、72、120 h腹腔注射生理鹽水2 mL/d。

1.2.2 焦慮行為觀察方法 參照 Pellow等［3～5］的方法制備高架十字迷宮，正中懸掛紅外攝像頭與擋板外電腦連接。實(shí)驗(yàn)時(shí)操作者位于擋板外，通過(guò)電腦屏幕觀察大鼠行為。焦慮行為指標(biāo)包括:①開(kāi)放臂次數(shù)（OE）:進(jìn)入到任一開(kāi)放臂的次數(shù)，以大鼠4個(gè)爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)。②開(kāi)放臂時(shí)間（OT）。③封閉臂次數(shù)（CE）:進(jìn)入到任一封閉臂的次數(shù)，以大鼠4個(gè)爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)。④封閉臂時(shí)間（CT）。⑤開(kāi)放臂和封閉臂的總次數(shù)（OE+CE）:表示大鼠的運(yùn)動(dòng)活力。⑥開(kāi)放臂次數(shù)比例（OE%）:即OE/（OE+CE）×100%。表示大鼠的焦慮程度，焦慮程度越嚴(yán)重該數(shù)值越小。⑦開(kāi)放臂停留時(shí)間比例（OT%）:即OT/（OT+CT）×100%，表示大鼠的焦慮程度，焦慮程度越嚴(yán)重該數(shù)值越小。

1.2.3 下丘腦組織神經(jīng)肽Y（NPY）mRNA檢測(cè)方法 行為學(xué)測(cè)試后大鼠乙醚麻醉，心臟灌注50 mL冰生理鹽水2次，按大鼠腦立體定位圖譜［10］將下丘腦取出后立刻放在凍存管中，放入液氮保存，再移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肦T-PCR方法檢測(cè)下丘腦組織NPY mRNA，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。取1 μL RNA進(jìn)行凝膠電泳，另取1 μL RNA稀釋10倍用Pharmacia Biotech GeneQuant DNA/RNA分光光度計(jì)測(cè)量OD260值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用多重比較秩和檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩樣本比較秩和檢驗(yàn)，各組組內(nèi)比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 焦慮行為比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠焦慮行為比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠焦慮行為比較（±s，n=10）

注:與 NS組24 h比較，*P ＜0.01;與 NS組120 h比較，△P ＜0.01;與 NS-SD 組120 h比較，▲P＜0.01;與 L-SD組120 h比較，#P ＜0.01

組別 OE（次） OT（s） CE（次） CT（s） OE+CE（次）OE% OT%NS 組24 h 2.40 ±0.84 33.30 ± 5.66 8.40 ±2.07 234.50 ±19.48 10.50 ±2.22 22.20 ±5.59 12.40 ±2.17 72 h 2.50 ±0.85 31.60 ± 5.30 8.60 ±2.01 233.70 ±16.45 11.10 ±2.42 22.50 ±6.36 12.00 ±2.00 120 h 2.50 ±1.08 32.60 ± 5.84 8.40 ±2.27 232.80 ±15.63 10.90 ±3.11 22.20 ±6.37* 13.30 ±2.79*NS-SD組24 h 4.50 ±1.90 42.10 ±19.96 11.60 ±2.50 201.50 ±36.73 15.80 ±3.94* 27.70 ±9.37▲ 17.70 ±8.86▲72 h 3.30 ±1.89 28.40 ±16.21 9.80 ±2.53 233.20 ±35.00 12.80 ±3.99 24.20 ±9.07▲ 11.00 ±6.57▲120 h 7.20 ±2.25 87.30 ±20.86 11.00 ±1.94 159.80 ±21.07 18.20 ±3.85△ 38.90 ±5.86△ 35.10 ±7.05△L-SD組24 h 4.30 ±2.21 51.30 ±27.79 11.20 ±3.52 195.70 ±37.26 15.40 ±5.36* 26.70 ±9.65# 20.40 ±10.97#72 h 3.40 ±1.84 30.50 ±15.15 9.80 ±2.82 231.70 ±33.37 12.90 ±4.18 25.10 ±9.29# 11.90 ±6.01#120 h 1.60 ±0.52 26.40 ±14.76 9.80 ±2.53 241.00 ±25.76 11.60 ±2.80△ 14.30 ±4.86△▲ 8.40 ±4.03△▲

2.2 下丘腦組織NPY mRNA NS-SD組、L-SD組各時(shí)間點(diǎn)下丘腦組織NPY mRNA表達(dá)量均高于相同時(shí)間點(diǎn) NS組（P＜0.05 或 ＜0.01）。24、72、120 h時(shí)NS-SD組下丘腦組織NPY mRNA表達(dá)量逐漸增加（P均＜0.05）;L-SD組表達(dá)量逐漸下降（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

睡眠剝奪可以顯著影響腦功能，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)而復(fù)雜的影響。無(wú)論在人體或動(dòng)物，研究均顯示睡眠時(shí)間減少或睡眠剝奪可導(dǎo)致睡眠體內(nèi)血清瘦素水平及節(jié)律幅度下降［6］。瘦素缺乏會(huì)影響睡眠深度，增加睡眠覺(jué)醒次數(shù)和轉(zhuǎn)換次數(shù)，減少動(dòng)物的總睡眠時(shí)間。因此，睡眠時(shí)間與瘦素水平有著極為密切的關(guān)系。睡眠剝奪還可導(dǎo)致大腦下丘腦食欲素及 NPY濃度增加，海馬區(qū) NPY水平上調(diào)［7］。NPY是一個(gè)促進(jìn)食欲的因子，具有明顯的抗焦慮作用。目前的研究認(rèn)為，主要由脂肪細(xì)胞分泌的瘦素是NPY最強(qiáng)的體內(nèi)抑制劑［8］。腦室內(nèi)注射N(xiāo)PY可表現(xiàn)出明顯的抗焦慮作用，并且這種作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系［9］。腦內(nèi)NPY系統(tǒng)被認(rèn)為是治療焦慮癥、抑郁癥及酒精依賴(lài)的候選靶標(biāo)［10］。NPY的抗焦慮作用主要通過(guò)Y1、Y5受體介導(dǎo)。通過(guò)對(duì)Y1、Y5受體的拮抗可以導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)焦慮行為［11］。研究［12］表明，NPY改善動(dòng)物的焦慮行為主要是在海馬及下丘腦發(fā)揮作用，而Y1和Y5受體激動(dòng)劑均具有抗焦慮作用。

表2 各組大鼠下丘腦組織NPY mRNA結(jié)果比較（ ± s，n=10）

表2 各組大鼠下丘腦組織NPY mRNA結(jié)果比較（ ± s，n=10）

注:與相同時(shí)間點(diǎn) NS組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;24、72、120 h時(shí)NS-SD組表達(dá)量逐漸增加（P均＜0.05），L-SD組表達(dá)量逐漸下降（P 均 ＜0.05）

組別NPY mRNA 24 h 72 h 120 h NS組1 355 ±37.15 1 276 ±38.16 1 078 ±40.35 NS-SD組 1 486±50.50* 1 609±45.15△ 1 836±40.18△L-SD組 1 640±70.13△ 1 554±80.30△ 1 262±50.00△

睡眠持續(xù)時(shí)間對(duì)瘦素的影響可能同時(shí)反映與瘦素相互作用的激素也受睡眠的調(diào)節(jié)。反之，瘦素的睡眠依賴(lài)性改變可能導(dǎo)致瘦素敏感的激素軸發(fā)生改變。有文獻(xiàn)報(bào)道，地震后出現(xiàn)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的患者較健康成人血清瘦素水平明顯增高，推測(cè)血清瘦素水平升高與患者的高警覺(jué)性有關(guān)［13］。研究證實(shí)，不合并抑郁癥的單純強(qiáng)迫癥患者血清瘦素水平升高［4］，而高瘦素血癥被認(rèn)為是產(chǎn)生焦慮的原因之一［14］，并被認(rèn)為是抗焦慮治療的新的潛在靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，瘦素睡眠剝奪組大鼠下丘腦NPY mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，表明下丘腦瘦素水平的增高對(duì)下丘腦NPY表達(dá)有抑制作用。REM睡眠剝奪組大鼠下丘腦NPY mRNA表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，表明睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠下丘腦NPY mRNA表達(dá)增高，且具有時(shí)間依賴(lài)性。睡眠剝奪的第72小時(shí)焦慮行為并未出現(xiàn)明顯變化;睡眠剝奪第120小時(shí)焦慮行為出現(xiàn)顯著改善，而瘦素可消除上述作用。表明下丘腦瘦素濃度的減少和NPY濃度的增加是一個(gè)逐漸變化的過(guò)程。因此，瘦素和NPY介導(dǎo)的通路很可能是睡眠剝奪導(dǎo)致抗焦慮作用的機(jī)制之一。但是，本研究采用單平臺(tái)睡眠剝奪模型，與改良多平臺(tái)模型相比，大鼠的社會(huì)隔離和制動(dòng)可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定影響。另外，本研究對(duì)下丘腦NPY的檢測(cè)僅限于基因水平，并未對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)。下一步研究將在蛋白水平進(jìn)行NPY檢測(cè)，并將對(duì)NPY的Y1、Y5受體進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，以完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增加其準(zhǔn)確性。

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