p53凋亡刺激蛋白抑制蛋白對(duì)乳腺癌患者生存時(shí)間的影響

姚朝峰，王長(zhǎng)松，王 鋒

ASPP1、ASPP2和 ASPP家族抑制成員 （inhibitory member of the ASPP family，iASPP）均屬于p53凋亡刺激蛋白 （apoptosis－stimulating protein of p53，ASPP）家族成員［1］，ASPP1／ASPP2 主要與 p53結(jié)合共同調(diào)節(jié)p53蛋白的生物學(xué)活性，促使細(xì)胞在發(fā)生DNA損傷后進(jìn)入凋亡程序；iASPP的功能則截然相反，它主要競(jìng)爭(zhēng)性地與p53蛋白結(jié)合，抑制野生型p53蛋白的促細(xì)胞凋亡活性，具有癌基因的特點(diǎn)。鑒于iASPP的生物學(xué)活性，深入研究iASPP在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式及對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，則有可能改變腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)，為高表達(dá)iASPP腫瘤的治療和預(yù)后提供一種新的思路。本文分析了iASPP在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)，同時(shí)對(duì)iASPP陽(yáng)／陰性乳腺癌患者的生存時(shí)間進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集解放軍第150醫(yī)院1999年01月—2010年12月收治的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的臨床資料，選取其中具有完整臨床和隨訪資料的89例作為研究對(duì)象。采用電話隨訪形式，隨訪至患者病死或截止日期（2010年12月）。術(shù)后2年內(nèi)隨訪 1次／3個(gè)月，3～5年隨訪 1次／6個(gè)月，5年后隨訪1次／12個(gè)月。隨訪內(nèi)容包括患者術(shù)后治療經(jīng)過(guò)，復(fù)查時(shí)間及結(jié)果，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間、部位，最終生存狀況?；颊呔鶠榕越?rùn)性導(dǎo)管癌，年齡27～79歲，中位年齡53．2歲。所有患者均接受了乳腺癌改良根治術(shù)。除7例難以耐受化療不良反應(yīng)外，其余均按照臨床標(biāo)準(zhǔn)化化療方案完成了6～9個(gè)療程的化療。中位隨訪時(shí)間為29個(gè)月（3～96個(gè)月）。

1．2 免疫組化檢測(cè) 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛液固定，常規(guī)HE切片染色。免疫組化采用EnVision二步法，濃縮型抗iASPP抗體購(gòu)自Abcam公司，經(jīng)1∶100稀釋后應(yīng)用。加入稀釋的iASPP多抗10 μl，置37℃孵箱中孵化30 min，以生理鹽水代替一抗作陰性對(duì)照；用 0．01M PBS 漂洗 3 次，加入二抗工作液 10 μl，室溫下孵化 30 min；用 0．01M PBS漂洗 3次，加入DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察，待出現(xiàn)特異性的棕色顆粒后終止顯色，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件中的Kaplan－Meier進(jìn)行生存分析，以 P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中iASPP的表達(dá) 89例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中有76例表達(dá)iASPP（85．4%），13 例不表達(dá)（14．6%），見圖1。

圖1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者iASPP的表達(dá)

2．2 生存分析 至隨訪結(jié)束，iASPP陽(yáng)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者病死17例（33．3%），iASPP陰性乳腺癌患者死亡 4 例（10．5%）。通過(guò) Kaplan－Meier法計(jì)算生存率得 χ2＝4．627，P＝0．031，兩組的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 iASPP陽(yáng)／陰性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者生存時(shí)間比較

3 討 論

野生型p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是機(jī)體對(duì)抗腫瘤的一種重要防御機(jī)制。細(xì)胞DNA損傷后，野生型p53基因的表達(dá)會(huì)大幅度增加，產(chǎn)生較多的p53蛋白，促進(jìn)受損細(xì)胞發(fā)生凋亡或停滯于S期進(jìn)行修復(fù)。野生型p53蛋白是如何決定DNA受損細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)程序或凋亡程序的？ASPP家族成員的發(fā)現(xiàn)則很好地回答了此問(wèn)題［1］。ASPP家族成員包括ASPP1、ASPP2和iASPP，三者在結(jié)構(gòu)上極為相似，即都具有3個(gè)典型的特征性結(jié)構(gòu)：4個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，SH3結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域［2］，其中SH3是其與p53結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)；缺少SH3結(jié)構(gòu)域和／或錨蛋白重復(fù)序列的截?cái)嘈蚷ASPP都不能與p53蛋白結(jié)合，因此也不具有抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。盡管三者均可與p53蛋白結(jié)合，但作用卻截然不同。在 ASPP1／ASPP2 存 在 時(shí) ，ASPP1／ASPP2 首 先 與p53結(jié)合，誘導(dǎo)p53蛋白與凋亡基因啟動(dòng)子的親和性發(fā)生改變，使DNA受損細(xì)胞走向凋亡。ASP1／ASPP2結(jié)構(gòu)的微小變化即可引起p53蛋白的功能發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響p53蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。iASPP則主要抑制p53蛋白的促細(xì)胞凋亡活性，抑制瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

ASPP蛋白家族的發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)后有著重要影響，通過(guò)抑制iASPP的表達(dá)可大幅度提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；同時(shí)阻斷iASPP后也將促使p53蛋白與ASPP1／ASPP2結(jié)合，促進(jìn)DNA受損細(xì)胞凋亡。研究顯示在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞株MCF－7中采用siRNA技術(shù)抑制iASPP的表達(dá)可以顯著增加瘤細(xì)胞的凋亡率［3－5］。iASPP 對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖和生存是必需的，可能會(huì)成為前列腺癌治療的靶標(biāo)［6］，iASPP 在肝細(xì)胞肝癌［7］和膠質(zhì)瘤細(xì)胞［8］的增殖中也起關(guān)鍵性的作用，iASPP可能是這些腫瘤治療的潛在靶標(biāo)。通過(guò)下調(diào)內(nèi)源性iASPP的表達(dá)能增加白血病細(xì)胞依賴 p53的凋亡發(fā)生率［9，10］。

150醫(yī)院課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，iASPP－mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中的表達(dá)率為87．9%（51／58）；免疫組化染色結(jié)果顯示 iASPP 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)率為 91．4%（53／58）。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在乳腺浸潤(rùn)性小葉癌組織中也有iASPP的表達(dá)。不同的年齡組iASPP－mRNA的表達(dá)差異也有顯著性；iASPP的表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；但與雌、孕激素受體的表達(dá)無(wú)關(guān)［11－13］。在本研究中筆者針對(duì) iASPP 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中的表達(dá)差異，研究了陽(yáng)性患者和陰性患者的生存時(shí)間，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)29～96個(gè)月的隨訪，iASPP表達(dá)陽(yáng)性患者的中位生存時(shí)間為（65．4±5．54） 個(gè)月，陰性患者的中位生存時(shí)間為（82．1±7．76）個(gè)月，二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此提示有必要檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中iASPP的表達(dá)情況，并加強(qiáng)隨訪，以期早發(fā)現(xiàn)其復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，針對(duì)iASPP高表達(dá)患者采取必要的靶向治療，以提高患者的生存時(shí)間和生存率。

［1］ Samuels－Lev Y，O Connor DJ，Bergamaschi D，et al．ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53 ［J］．Mol Cell，2001，8（4）：781－794．

［2］陳燕平，劉澤軍．ASPP蛋白家族在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用［J］．癌變 畸變 突變，2006，18（6）：488－450．

［3］ Laska MJ，Strandbygard D，Kjeldgaard A，et al．Expression of the RAI gene is conducive to apoptosis：studies of induction and interference［J］．Exp Cell Res，2007，313（12）：2611－2621．

［4］ Liu ZJ，Cai Y，Hou L，et al．Effect of RNA interference of iASPP on the apoptosis in MCF－7 breast cancer cells［J］．Cancer Invest，2008，26（9）：878－882．

［5］王長(zhǎng)松，李 紅，高春芳，等．iASPP對(duì)表達(dá)野生型p53基因的乳腺癌細(xì)胞株MCF－7凋亡的影響［J］．中國(guó)病理生理學(xué)雜志，2010，26（2）：282－286．

［6］ Zhang B，Xiao HJ，Chen J，et al．Inhibitory member of the apoptosis－stimulating protein of p53（ASPP） family promotes growth and tumorigenesis in human p53－deficient prostate cancer cells［J］．Prostate Cancer Prostatic Dis，2011，14（3）：219－24．

［7］ Lin BL，Xie DY，Xie SB，et al．Down－regulation of iASPP in human hepatocellular carcinoma cells inhibits cell proliferation and tumor growth［J］．Neoplasma，2011，58（3）：205－210．

［8］ Li G，Wang R，Gao J，et al．RNA interference－mediated silencing of iASPP induces cell proliferation inhibition and G0／G1 cell cycle arrest in U251 human glioblastoma cells［J］．Mol Cell Biochem，2011，350（1－2）：193－200．

［9］ Liu H，Wang M，Diao S，et al．siRNA－mediated down－regulation of iASPP promotes apoptosis induced by etoposide and daunorubicin in leukemia cells expressing wild－type p53［J］．Leuk Res，2009，33（9）：1243－1248．

［10］ Gillotin S．iASPP，a potential drug target in cancer therapy［J］．Leuk Res，2009，33（9）：1175－1177．

［11］王長(zhǎng)松，王仰坤，喬 亮，等．癌基因iASPP在乳腺癌細(xì)胞株和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)及意義［J］．實(shí)用醫(yī)藥雜志，2008，25（10）：1231－1234．

［12］陳燕平，劉澤軍，辛海明，等．ASPP家族成員mRNA在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，33（11）：1393－1394．

［13］陳燕平，孫良起，黃本成，等．癌基因iASPP在乳腺浸潤(rùn)性小葉癌中的表達(dá)及其意義［J］．中國(guó)普通外科雜志，2010，19（11）：1223－1226．