CDX2基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細胞向杯狀細胞分化的可行性研究

李毅，李欣，孫濤

1.第二軍醫(yī)大學(xué) 海軍臨床醫(yī)學(xué)院；2.海軍總醫(yī)院 消化內(nèi)科；北京 100048

潰瘍性結(jié)腸炎是一種發(fā)病機制涉及遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫異常、腸道菌群改變等多方面的腸道慢性非特異性炎癥，其確切病因尚未完全闡明，并且治療上也仍有局限性。潰瘍性結(jié)腸炎患者在病理上表現(xiàn)為結(jié)腸杯狀細胞數(shù)量減少、腸隱窩破壞、病變部位黏膜粘液層變薄、腸道菌群發(fā)生改變[1-2]。這使得腸道內(nèi)細菌更易直接損傷腸黏膜，腸道抗原更易造成黏膜免疫炎癥反應(yīng)。通過增加杯狀細胞數(shù)目、增強杯狀細胞分泌粘蛋白能力，有利于腸道黏膜屏障恢復(fù)及腸道保護。尾型同源盒2（caudal type homeobox 2，CDX2）基因是腸道上皮特異性基因，同時也是胚胎發(fā)育過程中促進限制內(nèi)胚層向后腸發(fā)育的關(guān)鍵基因[3]。CDX2 還能特異性結(jié)合腸道黏液蛋白（mucin-2，MUC2）基因的啟動子，促進MUC2 的表達。另一方面，臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）除具有多向分化能力外，已證明其可通過歸巢效應(yīng)到達腸道炎癥部位。所以利用CDX2修飾UC-MSC，使之向杯狀細胞分化或大量表達MUC2，對治療潰瘍性結(jié)腸炎具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

臍帶組織來源于海軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科。重組質(zhì)粒CDX2-IRES-EGFP 由上海吉凱基因公司構(gòu)建；TRIzol total RNA 試劑盒、無血清替代物KSR 購于Invitrogen 公司；PCR 反應(yīng)試劑盒購于TaKaRa 公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購于QIGENE 公司；DMEM 培養(yǎng)基及小牛血清購于Hyclone 公司；Activin A 與Wnt3a 購于PeproTech 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購于Promega 公司；Xfect Adult Stem Cell 轉(zhuǎn)染試劑購于Clontech公司。

1.2 UC-MSC的培養(yǎng)與鑒定

經(jīng)孕婦知情同意，取剖宮產(chǎn)手術(shù)中足月產(chǎn)新生兒臍帶30 cm 左右，在超凈臺中分離臍帶血管與外膜間的膠凍樣組織，將其剪成1 mm3大小，于37℃、5% CO2條件下原代培養(yǎng)10 d，待大量細胞從組織爬出后去除組織，用0.25%胰蛋白酶消化瓶底5 min，1000 r/min 離心5 min，將爬出細胞集中到4 個25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d 換一次液，待細胞長到80%～90%融合時進行傳代；取第3 代穩(wěn)定增殖的UC-MSC，用胰蛋白酶消化5 min，1000 r/min 離心5 min 后用PBS 清洗2 次，細胞計數(shù)后懸浮于PBS溶液中，使細胞濃度為1.0×106/mL，分別加入鼠抗人單克隆抗體PE-CD45、PE-CD105、PE-CD73、PEHLA-DR、FITC-CD90、FITC-CD34 及PE-IgG2a、PE-IgG1K、FITC-IgG1K 同型對照抗體，常溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次后立即行流式細胞檢測。

1.3 UC-MSC向內(nèi)胚層方向誘導(dǎo)

在DMEM/F12 培養(yǎng)基中加入100 ng/mL 重組人Activin A、50 ng/mL Wnt3a、10% KSR、100 U/mL青霉素、100μg/mL 鏈霉素，配成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將第2代細胞按1∶2 傳代后，對其中一半數(shù)量的細胞采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)5 d，另一半細胞仍以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR 檢測Sox17 與GATA4 在UC-MSC 中的表達

針對Sox17 及GATA4 設(shè)計引物行RT-PCR。Sox17 正向引物為5'-GTGGACCGCACGGAATTTG-3'，反向引物為5'-GGAGATTCACACCGGAGTCA-3'；MUC2 正向引物為5'-CGACACCCCAATCTCGA TATG-3'，反向引物為5'-GTTGCACAGATAGTGAC CCGT-3'。反應(yīng)條件：94℃ 5 min 預(yù)變性，然后以94℃30 s、60℃30 s、72℃l min 行36個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)體系包括10×PCR 緩沖液2.5μL、dNTP 混合液1μL、正反向引物各0.25μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL、cDNA 1μL、ddH2O 19.75μL。

1.5 UC-MSC的轉(zhuǎn)染

將經(jīng)過誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的第3代UC-MSC 以2×105接種到6 孔板中，其中單轉(zhuǎn)組、空轉(zhuǎn)組、對照組接種未經(jīng)誘導(dǎo)的UC-MSC，單誘組、誘轉(zhuǎn)租接種經(jīng)過誘導(dǎo)的UC-MSC，每組3 孔，每孔加入2 mL 無抗生素的DMEM 完全培養(yǎng)基，待細胞長到60%～70%融合時對空轉(zhuǎn)組、單轉(zhuǎn)組、誘轉(zhuǎn)組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作按照Xfect Adult Stem Cell 轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明進行，37℃孵育4 h，然后吸出所有培養(yǎng)基并換之以2 mL新鮮培養(yǎng)基。

1.6 轉(zhuǎn)染后細胞的熒光顯微鏡觀察

分別于轉(zhuǎn)染后24、48 h 在熒光顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染情況，隨機計數(shù)5個視野的總細胞數(shù)和具有綠色熒光的細胞數(shù)。

1.7 RT-PCR 檢 測CDX2 與MUC2 在UC-MSC 中 的表達

針對CDX2 及MUC2 設(shè)計引物行RT-PCR。CDX2 正向引物為5'-GACGTGAGCATGTACCCTA GC-3'，反向引物為5'-GCGTAGCCATTCCAGTCCT-3'；MUC2 正向引物為5'-ATGACAACGGACGAC A CAGAA-3'，反向引物為5'-TCAGCGTTTGAGTTTC CAGAG-3'。反應(yīng)條件：94℃5 min 預(yù)變性，然后以94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 行36 個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTP 混合液1μL、正反向引物各0.25μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL、cDNA 1μL、ddH2O 19.75μL。

1.8 UC-MSC 的內(nèi)胚層誘導(dǎo)在CDX2 促進UC-MSC表達MUC2中的作用評價

用相對增長率R表示當(dāng)CDX2 增加相同倍數(shù)時MUC2的表達增長率。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UC-MSC流式細胞術(shù)檢測

經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，培養(yǎng)至第3 代的細胞CD105、CD90、CD73 均呈陽性表達，陽性率分別為97.4%、99.0%、97.8%，而HLA-DR、CD34、CD45 陽性率分別為0.7%、0.5%、0.3%（圖1），所得細胞免疫表型符合間充質(zhì)干細胞免疫表型特點。

2.2 內(nèi)胚層細胞標志物Sox17、GATA4 的mRNA 表達

用重組人Activin A、重組人Wnt3a 誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d，對誘導(dǎo)細胞行RT-PCR，結(jié)果Sox17 的mRNA 表達量升高54 倍（P＜0.05），GATA4 升高27 倍，兩者變化均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。凝膠電泳（圖2）顯示，誘導(dǎo)組標志基因Sox17、GATA4 的條帶均比未誘導(dǎo)組明顯。

2.3 熒光鏡檢轉(zhuǎn)染后細胞熒光表達情況

單轉(zhuǎn)組、空轉(zhuǎn)組、誘轉(zhuǎn)組在48 h 后均見綠色熒光蛋白表達，其中空轉(zhuǎn)組熒光強度較強，可見熒光細胞較多，轉(zhuǎn)染效率約70%；單轉(zhuǎn)組與誘轉(zhuǎn)組熒光強度較弱，轉(zhuǎn)染效率分別約為30%和40%。對照組、單誘組細胞生長狀態(tài)較好，熒光鏡下未見綠色熒光表達。5 組細胞形態(tài)均為長梭形或不規(guī)則形，排列呈漩渦狀，未見圓形杯狀細胞或類杯狀細胞。見圖3。

2.4 RT-PCR檢測CDX2與MUC2的mRNA表達

瞬時轉(zhuǎn)染后48 h，對5 組細胞行RT-PCR，結(jié)果如圖4，與對照組相比，單轉(zhuǎn)組UC-MSC 表達CDX2水平升高113.3 倍，MUC2 表達升高30.2 倍；誘轉(zhuǎn)組UC-MSC 表達CDX2 水平升高196.7 倍，MUC2表達升高98.8 倍，空轉(zhuǎn)組、單誘組CDX2 與MUC2 無顯著改變。凝膠電泳（圖5）提示誘轉(zhuǎn)組條帶最清晰，其次是單轉(zhuǎn)組、空轉(zhuǎn)組與單誘組，對照組未見明顯條帶。

2.5 單轉(zhuǎn)組與誘轉(zhuǎn)組MUC2增長情況比較

單轉(zhuǎn)組MUC2 相對增長率R=26.7%，誘轉(zhuǎn)組MUC2 相對增長率R=50.2%。經(jīng)兩獨立樣本t檢驗，MUC2相對于CDX2的增長率，誘轉(zhuǎn)組顯著高于單轉(zhuǎn)組（P＜0.05）。說明在CDX2 增長倍數(shù)相同的情況下，經(jīng)過誘導(dǎo)的UC-MSC 表達的MUC2 量更多，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 UC-MSC的流式細胞檢測結(jié)果

3 討論

圖2 Sox17與GATA4的PCR產(chǎn)物凝膠電泳

CDX2是一種在腸道黏膜特異性表達的基因，它也是胚胎發(fā)育過程中促進內(nèi)胚層向后腸發(fā)育的關(guān)鍵基因，在胚胎發(fā)育過程中多種途徑促進內(nèi)胚層向后腸分化最終都集中到對CDX2 的控制[3-4]。從胚胎發(fā)育的第8周開始，胎兒的胃腸道即可檢測出CDX2表達，在人體正常上皮細胞中，CDX2 可表達于內(nèi)胚層來源的腸道上皮及胰腺導(dǎo)管和腺泡上皮，但CDX2在食管和正常胃黏膜上皮中不表達。除消化系統(tǒng)外，其他各系統(tǒng)正常上皮內(nèi)也檢測不到CDX2[5]。CDX2 在肺、食管、胃激活后組織會向腸上皮組織化生[6]。CDX2 修飾的食管上皮細胞還可以表達腸道粘蛋白MUC2，這也是Barrett 食管中能見到杯狀細胞的原因。其主要機制可能是：①CDX2通過促進無調(diào)同源物-1（atonal homolog-1，ATOH1）表達上升促進MUC2 的表達[7]；②CDX2 直接與MUC2 的啟動子相互作用，啟動MUC2 表達[8]。由于CDX2 是腸道上皮細胞分化關(guān)鍵基因，同時又有直接激活粘蛋白MUC2 的作用，所以我們選擇CDX2 作為UC-MSC 的修飾基因。本實驗中UC-MSC 在誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d 后，RT-PCR 結(jié)果顯示Sox17 表達升高54 倍，GATA4 表達升高27 倍。說明誘導(dǎo)培養(yǎng)促進了UC-MSC 向內(nèi)胚層細胞的分化。實驗中，單轉(zhuǎn)組、誘轉(zhuǎn)組、空轉(zhuǎn)組均進行了轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下均能看到熒光蛋白表達，但單轉(zhuǎn)組與誘轉(zhuǎn)組熒光較弱，空轉(zhuǎn)組熒光較強。其原因可能是：①UC-MSC 對轉(zhuǎn)染試劑的敏感性低，轉(zhuǎn)染效率受到限制；②由于轉(zhuǎn)染試劑毒性影響了細胞活力，對質(zhì)粒蛋白表達有較大影響；③誘轉(zhuǎn)組與單轉(zhuǎn)組實質(zhì)上是CDX2與綠色熒光蛋白（EGFP）通過內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）實現(xiàn)的雙基因共表達，在總體轉(zhuǎn)染效率受限的情況下，IRES 片段下游的EGFP表達效率還會下降60%以上，進一步減弱了視野下熒光蛋白的熒光量。RT-PCR 結(jié)果顯示，單純轉(zhuǎn)染組CDX2 表達量上升了113 倍，MUC2 上升了30倍，這進一步說明CDX2 對杯狀細胞標志蛋白即粘蛋白MUC2 表達的直接促進作用，同時證明了經(jīng)CDX2 修飾的UC-MSC 有向成熟杯狀細胞分化的可能性，而且在細胞治療領(lǐng)域，經(jīng)CDX2 修飾的UCMSC 可作為修復(fù)UC 患者黏液層的可選細胞。另一方面，單誘組CDX2 與MUC2 表達無明顯改變，說明Activin A 與Wnt3a 誘導(dǎo)培養(yǎng)對內(nèi)源性CDX2 與MUC2 的增加無影響，CDX2 的表達是MUC2 表達的必需因素。誘轉(zhuǎn)組CDX2 與MUC2 表達分別升高了197 與99 倍，說明可能經(jīng)過Wnt3a 與Activin A 誘導(dǎo)后，UC-MSC 對轉(zhuǎn)染的敏感性提高，CDX2 表達隨之上升。值得注意的是，MUC2隨CDX2上升的過程并非等比例，經(jīng)誘導(dǎo)處理的UC-MSC 的MUC2 相對增長率顯著高于單純轉(zhuǎn)染CDX2 的UC-MSC。這說明在過表達CDX2 的前提下，對UC-MSC 的誘導(dǎo)培養(yǎng)也是促進MUC2 上升的因素，也就是說，對UC-MSC向內(nèi)胚層細胞的誘導(dǎo)有利于MUC2 的表達。其機制可能是MUC2 的表達除受CDX2 的直接調(diào)控外還受其他基因控制，而把UC-MSC 向內(nèi)胚層誘導(dǎo)后，能促進MUC2 表達的其他調(diào)控基因表達也增強，從而進一步增加MUC2 的表達。本實驗雖然增加了UCMSC 表達杯狀細胞標志物MUC2，但并未觀察到典型的杯狀細胞形態(tài)，轉(zhuǎn)染48 h 的細胞仍以長梭形或多邊形為主，考慮原因主要是：①雖然經(jīng)過誘導(dǎo)及基因修飾，MUC2 的表達顯著上升，但由于MUC2 基礎(chǔ)水平較低，所以仍達不到杯狀細胞產(chǎn)生所需的MUC2量；②實驗僅對MUC2的變化在mRNA 水平進行探討，缺少蛋白水平，所以并不能證明MUC2 蛋白的產(chǎn)生確實升高。因此，要想得到典型的杯狀細胞，還須優(yōu)化實驗條件。本實驗結(jié)果說明，在UC-MSC中過表達CDX2 能夠增加杯狀細胞標志物粘蛋白MUC2 的表達，而事先誘導(dǎo)UC-MSC 向內(nèi)胚層細胞分化，能進一步增加MUC2 的表達，但要得到典型杯狀細胞或更大量的MUC2還須優(yōu)化實驗條件。

圖3 熒光鏡檢轉(zhuǎn)染后細胞熒光表達情況（100×）

圖4 各組細胞CDX2與MUC2的mRNA表達情況

圖5 CDX2與MUC2的PCR產(chǎn)物凝膠電泳

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