PC-1解除S6K對AKT信號通路的負反饋抑制

張曉清 ，王健，王洪濤，李山虎，王芃，黃芳，洪鎏，鄧楚中，周建光

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；2.貴陽醫學院，貴州 貴陽 550004

前列腺癌是男性生殖系統常見惡性腫瘤之一，在歐美國家其發病率居首位，死亡率高居第二位[1]。PC-1/PrLZ基因是癌基因D52家族成員，其在雄激素非依賴性前列腺癌C4-2 細胞中高表達而在雄激素依賴性LNCaP 細胞中低表達，且隨著前列腺癌分級的增加表達上升[2-3]。研究發現，PC-1 可以激活PI3K/AKT 信號通路，進而抑制雄激素，剝奪對前列腺癌細胞的凋亡誘導作用[4-5]。PI3K/AKT 信號通路可以通過調節細胞凋亡、細胞增殖、促進血管生成和腫瘤發育等促進前列腺癌雄激素非依賴進展，而PC-1如何激活該信號通路還不清楚。

我們利用慢病毒系統建立了過表達和干擾PC-1表達的前列腺癌細胞模型，在此基礎上發現PC-1可以抑制mTOR 激酶信號通路下游分子S6K 的活性，進而解除了S6K對AKT的負反饋抑制功能，從而激活AKT激酶的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、LNCaP 及C4-2 細胞，大腸桿菌DH5α，PC-1基因真核表達質粒pCDNA-HA-PC-1，慢病毒包裝輔助質粒由本室保存；DMEM 及RPMI1640培養基購自GIBCO 公司；優等胎牛血清（FBS）為Hyclone公司產品；慢病毒過表達載體pCDH-EF1-Myc-MCS-T2A-Puro和干擾表達載體pSIH1-H1-Puro 由金蕊博士饋贈；限制性內切酶、Pfu酶和DNA 連接酶購自TaKaRa 公司；質粒提取、膠回收和PCR 回收試劑盒，轉染試劑VigoFect 均為維格拉斯公司產品；聚凝胺（Polybrene）、嘌呤霉素購自Santa Cruz 公司；PC-1 多克隆抗體由本室自制；γ-tubulin 及抗S6Kp389、S6K、AKT、p308-AKT 抗體購自Cell Signaling公司；蛋白酶抑制劑購自Sigma 公司；雷帕霉素、RAD001和AG1024購自Selleck公司。

1.2 短發夾RNA（shRNA）慢病毒重組質粒的構建與鑒定

PC-1的shRNA 靶點為GCTATCTCTACTTGTC TCC，以此設計shRNA 正義鏈序列（5'-GATCCGCT ATCTCTACTTGTCTCCCTTCCTGTCAGAGGAGACA AGTAGAGATAGCTTTTTG-3'）和反義鏈序列（5'-AATTCAAAAAGCTATCTCTACTTGTCTCCTCTGAC AGGAAGGGAGACAAGTAGAGATAGCG-3'）。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切shRNA 表達載體pSIH1-H1-Puro，回收后與退火的PC-1shRNA 片段連接，構建PC-1shRNA 慢病毒重組質粒，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆送上海英駿生物技術公司測序鑒定。

1.3 PC-1過表達慢病毒重組質粒的構建

PC-1基因正向引物為5'-ACGGATCCGATTGT AGAGAGATGGAC-3'，反向引物為5'-GAGCGGCC GCCAGGCTCTCCTGTGTCTT-3'。以pcDNA-HAPC-1 為模板，PCR 擴增并切膠回收PC-1基因DNA片段；分別將載體pCDH-EF1-Myc-MCS-Puro和PC-1回收片段用BamHⅠ/NotⅠ于37℃雙酶切12 h，酶切產物切膠回收后于16℃連接12 h，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單克隆提取質粒，用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定。

1.4 慢病毒的包裝

適量293T 細胞接種于100 mm 培養皿，約24 h后轉染，包裝4種質粒慢病毒，即PC-1shRNA、其對照載體pSIH1-H1-Puro、過表達PC-1載體和對照載體pCDH-EF1-Myc-MCS-Puro。將4 種質粒分別與3 個包裝質粒（REV，VSVG，RRE）在空白DMEM 中混合，加入VigoFect 轉染試劑混勻后室溫靜置20 min，分別加入4 皿細胞培養液中，37℃孵箱培養12 h 后，換成含10% FBS 的RPMI1640 培養液，48 h 后收集上清，經0.45μm 濾膜過濾即得包裝好的病毒，直接加到待感染細胞中或于-80℃保存。

1.5 前列腺癌細胞系的建立

接種LNCaP、C4-2細胞于100 mm 培養皿中，用含10% FBS 的RPMI1640 培養液培養，24 h 后加入包裝好的含有過表達PC-1及其對照載體、敲低PC-1表達及其對照載體的4種病毒液，同時加入終濃度為5μg/mL 的Polybrene，病毒感染10 h 后換成普通培養液，48 h后傳代，傳代時培養液里加入2μg/mL嘌呤霉素篩選，進一步培養鑒定。

1.6 Western印跡分析

收集細胞，提取總蛋白，將蛋白提取液與5×SDS上樣緩沖液以4∶1 的體積比混勻，煮沸10 min 后離心，取樣進行SDS-PAGE 后，電轉移至硝酸纖維素膜上；將膜用5%脫脂奶粉于室溫封閉30 min；加入所需一抗于室溫孵育1 h 或4℃過夜后，TBST 洗膜3次，每次7 min；用相應的二抗孵育后，洗膜3 次，每次5 min；用化學發光法壓片顯影。

2 結果

2.1 建立過表達PC-1 的LNCaP 穩定細胞系及敲低PC-1表達的C4-2穩定細胞系

包裝慢病毒后分別感染前列腺癌LNCaP和C4-2 細胞，嘌呤霉素篩選后收集細胞，提取總蛋白，Western 印跡檢測細胞內PC-1 的表達水平，結果見圖1。相對于各自對照細胞，LNCaP 細胞中的PC-1蛋白表達水平明顯上升，而感染PC-1shRNA 慢病毒C4-2 細胞中的PC-1 蛋白表達水平明顯下降，表明穩定細胞系構建成功。

2.2 PC-1抑制前列腺癌細胞中S6K激酶的活性

為檢測PC-1 是否影響AKT 信號通路下游mTOR信號通路活性，我們檢測了細胞內S6K-p389、70S6K 表達水平。結果表明LNCaP 細胞中PC-1 過表達對總蛋白表達水平沒有影響，但抑制其磷酸化水平（圖2A）；在C4-2細胞中，敲低PC-1表達使S6K磷酸化水平上升（圖2B），對總蛋白水平沒有影響。提示PC-1能夠調控S6K激酶的活性。

為進一步證實這一結果,我們用不同濃度的mTOR 抑制劑雷帕霉素平行處理這4 種細胞，24 h后提取細胞總蛋白進行Western 印跡檢測。結果顯示（圖2C），雷帕霉素呈劑量效應型抑制S6K-p389水平；而PC-1 高表達能夠增強雷帕霉素對S6Kp389 的抑制作用，敲低PC-1 表達能夠抑制雷帕霉素對S6K-p389的抑制作用。進一步表明PC-1能夠抑制前列腺癌細胞中S6K激酶的活性。

2.3 PC-1 解除S6K 激酶對AKT 激酶活性的負反饋抑制

圖1 PC-1過表達及敲低表達前列腺癌穩定細胞系的鑒定

圖2 PC-1調控前列腺癌細胞中S6K激酶的活性

圖3 PC-1解除S6K負反饋調控AKT信號通路

LNCaP、LNCaP-PC-1 細胞中S6K和AKT 磷酸化水平檢測結果見圖3。PC-1過表達時S6K 磷酸化水平下降，而AKT的磷酸化水平上升；當用mTOR抑制劑RAD001 處理細胞完全抑制S6K 的活性后，PC-1過表達和對照細胞中AKT 的磷酸化水平相當。提示PC-1可能通過抑制S6K 活性，解除S6K 對AKT 激酶活性的負反饋抑制作用，進而上調AKT活性。

3 討論

AKT信號通路在腫瘤細胞中異常激活導致細胞的表型惡性轉化，mTOR 蛋白激酶是PI3K/AKT 信號通路下游的重要組分。mTOR 信號通路主要包含2個蛋白復合體mTORC1和mTORC2。mTORC1 通過調控它的2 個底物分子S6K和4E-BP1 來調控細胞的大小和蛋白質翻譯；mTORC2 參與了對AKT 第473氨基酸殘基的磷酸化調控[6-7]。

mTOR 依賴的S6K 磷酸化激活參與了蛋白質的翻譯起始和延伸，但該分子的激活又啟動了一條負反饋通路抑制AKT 信號通路活性[8]。我們首先發現過表達PC-1 在前列腺癌細胞中能夠激活AKT 信號通路，同時能抑制S6K 的磷酸化水平，提示PC-1 可能解除了S6K對AKT活性的負反饋抑制作用。雷帕霉素及其衍生物RAD001 是mTOR 信號通路的有效抑制劑，能抑制其下游底物分子如S6K 的活性。用RAD001 處理PC-1 過表達及對照LNCaP 細胞，當S6K 活性被完全抑制后，PC-1 對AKT 激酶的激活作用消失，提示PC-1對S6K 激酶活性的調控參與了其對AKT活性的調控。

本研究表明PC-1 通過抑制mTOR 信號通路下游分子S6K 激酶的活性，解除了S6K 對AKT 信號通路的負反饋抑制，從而激活AKT 信號通路。這一結果揭示了PC-1激活AKT活性的可能分子機制。

[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2008[J].CA Cancer J Clin,2008,58:71-96.

[2]Wang R,Xu J,Saramaki O,et al.PrLZ,a novel prostate-specific and androgen-responsive gene of the TPD52 family,amplified in chromosome 8q21.1 and overexpressed in human prostate cancer[J].Cancer Res,2004,64:1589-1594.

[3]Wang R,Xu J,Mabjeesh N,et al.PrLZ is expressed in normal prostate development and in human prostate cancer progression[J].Clin Cancer Res,2007,13:6040-6048.

[4]Zhang H,Wang J,Pang B,et al.PC-1/PrLZ contributes to malignant progression in prostate cancer[J].Cancer Res,2007,67:8906-8913.

[5]Zhang D,He D,Xue Y,et al.PrLZ protects prostate cancer cells from apoptosis induced by androgen deprivation via the activation of Stat3/Bcl-2 pathway[J].Cancer Res,2011,71:2193-2202.

[6]Guertin D A,Sabatini D M.Defining the role of mTOR in cancer[J].Cancer Cell,2007,12:9-22.

[7]Sarbassov D D,Guertin D A,Ali S M,et al.Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex[J].Science,2005,307:1098-1101.

[8]Harrington L S,Findlay G M,Gray A,et al.The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins[J].J Cell Biol,2004,166:213-223.