人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表達、純化及活性檢測

黃蓉 ，徐小潔，王濤，馮瀅瀅，周麗英，李玲，冀全博，杜楠，葉棋濃

1.解放軍總醫院 第一附屬醫院，北京 100048；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850

14-3-3 是一個高度保守的基因家族，在真核細胞中廣泛分布，并參與許多重要的細胞生理過程,如生長分化、周期調控和凋亡、信號傳導和遷移，以及惡性腫瘤的形成等[1]。14-3-3 蛋白最初是在哺乳動物的大腦中發現的[2]，目前在哺乳動物中至少存在7 個亞型（β，ε，η，γ，τ，ζ和σ）[3]。14-3-3 蛋白相對分子質量為（25～30）×103，是一個調節蛋白家族[4]，可通過與靶蛋白結合，調控蛋白活性及蛋白胞內定位等，從而調節細胞G2/M 期和G1/S 期轉換[5]，參與腫瘤的發生發展[6-7]。為了深入研究14-3-3 在調控細胞周期中的相互作用蛋白，我們從人乳腺文庫中擴增出14-3-3σ基因的全長編碼序列，通過連接原核表達載體構建含14-3-3σ基因的重組質粒，在原核系統中表達并純化得到14-3-3σ蛋白，檢測其生物活性，為后續探討14-3-3σ蛋白在調控細胞周期運行與腫瘤發生發展中的作用奠定了實驗學基礎。

1 材料和方法[8]

1.1 材料

人乳腺文庫，人胚腎細胞293T，大腸桿菌DH5α、Rossate，原核表達載體pGEX-KG 為本室保存；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性核酸內切酶、高保真Primer STAR HS DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶為TaKaRa 公司產品；VigoFect 為威格拉斯生物技術有限公司產品；質粒提取試劑盒為Promega 公司產品；GST-Sepharose 4B珠子購自Pharmacia公司；DNA膠回收試劑盒、PCR 產物回收試劑盒為北京天根生物科技有限公司產品；辣根過氧化物酶偶聯的抗GST、FLAG 單克隆抗體（mAb）購自Sigma 公司；其余化學試劑為國產分析純產品；測序由北京華大基因公司完成。

1.2 人14-3-3σ全長編碼區基因的擴增

以人乳腺文庫為模板，根據文獻報道的人14-3-3σ基因序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATG GAGAGAGCCAGTCTGATCCA-3'）和下游引物（5'-CGGAATTCTCAGCTCTGGGGCTCCTGGGG-3'），用Primer STAR HS DNA 聚合酶，PCR 擴增人14-3-3σ基因片段（擴增條件：95℃5 min 預變性，然后以94℃ 1 min、62℃ 45 s、72℃ 1 min 行30 個循環，72℃延伸7 min）。擴增產物經10 g/L 瓊脂糖DNA膠檢測，以瓊脂糖DNA膠回收試劑盒回收。

1.3 重組質粒的構建及原核表達鑒定

膠回收的擴增產物用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，載體pGEX-KG也用相同酶雙酶切，膠回收載體大片段，將2 個酶切產物用T4DNA 連接酶于16℃連接12 h后轉化大腸桿菌DH5α，涂LB（Amp抗性）平板，37℃培養過夜，挑選單克隆，提取質粒，經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，將正確質粒送北京華大基因公司測序。

1.4 融合蛋白GST-14-3-3σ在大腸桿菌中的小量誘導表達及鑒定

將鑒定正確的重組表達質粒pGEX-KG-14-3-3σ轉化大腸桿菌Rossate 感受態細胞，挑取菌落，37℃振蕩培養至D600nm為0.6～1.0，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續培養4～6 h，離心收集菌體，進行SDS-PAGE和Western印跡檢測。

1.5 融合蛋白GST-14-3-3σ的純化

分別將含pGEX-KG-14-3-3σ和含pGEX-KG空載體的Rossate 菌株同時接種于Amp 抗性的LB 液體培養基中,37℃振蕩培養過夜活化，按2%的比例轉接于同種液體培養基中，30℃振蕩培養至D600nm為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，20℃繼續培養20 h 以上，離心收集菌體，按Pharmacia 公司提供的方法進行GST 融合蛋白的純化，加入裂解液進行超聲波破碎，12 000 r/min 離心收集上清，加入適量GST-Sepharose 4B 珠子，4℃旋轉結合4 h 后3000 r/min 低速離心收集GST-Sepharose 4B 小顆粒，緩沖液充分洗脫未結合蛋白質，最后以SDSPAGE鑒定純化蛋白。

1.6 GST pull-down分析

將人胚腎細胞293T 以70%的密度，用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養基接種于直徑為6 cm的培養皿中，培養24 h后，用VigoFect轉染試劑將帶Flag 標簽的AKT 真核表達質粒轉染293T 細胞，4～6 h 后換培養液，在37℃、5% CO2條件下培養24 h，收細胞后加入IP 緩沖液500μL，冰上裂解細胞30 min，將裂解的細胞于冰上超聲波破碎，12 000 r/min、4℃離心10 min，收集上清，將上步純化的GST-14-3-3σ蛋白及GST 蛋白分別加到細胞裂解后的上清中，4℃旋轉結合3～6 h，3000 r/min 離心收集珠子，緩沖液充分洗脫未結合蛋白，Western印跡檢測2種蛋白質之間是否存在體外直接相互作用。

2 結果

2.1 人14-3-3σ編碼區基因的克隆

以人乳腺文庫為模板擴增獲得約750 bp 的PCR產物，與預期片段大小一致（圖1）。

2.2 重組表達載體pGEX-14-3-3σ的構建與鑒定

將PCR 產物和pGEX-KG 載體分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將2 個酶切產物用T4DNA 連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，提質粒后酶切鑒定，DNA 凝膠電泳可見約750 bp 的條帶（圖2），表明14-3-3σ基因編碼序列已插入pGEXKG 上游的多克隆位點中。DNA 序列測定結果顯示與已知序列完全一致，且無突變發生（數據略）。

圖1 目的基因14-3-3σ的PCR擴增

2.3 融合蛋白GST-14-3-3σ的誘導表達及鑒定

將pGEX-KG 空載體和鑒定正確的重組質粒pGST-14-3-3σ分別轉化Rossate 感受態細胞，挑選克隆并振蕩培養，經IPTG 于37℃小量誘導3～4 h 后收集菌體，對誘導前后的菌體用考馬斯亮藍染色鑒定和Western 印跡檢測，發現GST-14-3-3σ融合蛋白表達正確（圖3）。

2.4 融合蛋白GST-14-3-3σ的純化

用GST-Sepharose 4B 親和珠純化獲得融合蛋白GST-14-3-3σ，考馬斯亮藍染色鑒定結果顯示純化效果較好，得到純度較高的GST-14-3-3σ融合蛋白和GST蛋白（圖4）。

2.5 GST pull-down分析

根據文獻報道，14-3-3蛋白可與AKT 蛋白相互作用，可據此進一步證實純化的GST-14-3-3σ融合蛋白是否具有生物學活性。將帶有GST-14-3-3σ的純化珠子與過表達Flag-AKT 的293T 細胞裂解液于4℃結合3～4 h，用抗Flag-HRP 抗體（1∶2000 稀釋）行Western 印跡檢測，結果顯示AKT 蛋白（Mr約57 000）位置有特異性條帶（圖5），而GST 載體蛋白在同一位置無此條帶，說明14-3-3σ蛋白與AKT 蛋白能夠在體外特異性結合并相互作用，且GST 標簽并不影響14-3-3σ蛋白的結構及其生物學功能。

圖2 重組質粒GST-14-3-3σ的酶切鑒定

圖3 GST-14-3-3σ融合蛋白的SDS-PAGE（A）和Western印跡（B）

3 討論

哺乳動物的14-3-3 蛋白是由2 個單體連接形成的杯狀二聚體結構，每個單體由9個α螺旋反向平行排列成“L”型結構，其二聚體界面主要由一個單體的αA 與另一個單體的αC和αD 構成，疏水性殘基和極性殘基共同形成高度保守的兼性溝槽，是調節14-3-3 與靶蛋白結合的結構基礎[9-10]。目前已發現200 多種蛋白可與14-3-3 蛋白家族成員相互作用，作用方式主要有2 種，即磷酸化和非磷酸化。大多數蛋白通過磷酸化途徑與14-3-3蛋白相互作用，這類蛋白主要包括受體蛋白（IGF-1）、轉錄調控蛋白、細胞周期調控蛋白（Cdc25、P53）等[11]；還有少數蛋白如Bax以非磷酸化途徑和14-3-3蛋白相互作用。

14-3-3 蛋白調控靶蛋白的方式主要有以下幾種：①改變靶蛋白與其他結合蛋白的相互作用，如14-3-3 蛋白和Bad 結合，促使Bad和Bcl-xL/Bcl-2分離[12]；②保護靶蛋白，使其免于蛋白酶或磷酸酶的作用，如14-3-3 蛋白可使Raf 免于磷酸酶的去磷酸化作用[13]；③抑制或增強靶蛋白的催化活性，如14-3-3蛋白可抑制ASK-1的活性[14]；④調控靶蛋白核漿轉運及亞細胞定位，如14-3-3 蛋白可促進Cdc2/周期蛋白B1 復合物由細胞核向胞漿轉運[15]；⑤作為支架蛋白/接頭蛋白，介導靶蛋白之間的相互作用，如14-3-3 蛋白可以介導Raf和Brc、Raf和PKC 的相互作用[16]；⑥改變靶蛋白DNA 結合活性，如DNA 損傷后，14-3-3蛋白可與P53結合，增強P53的DNA結合活性[17]。以上幾種調控機制既可以單獨作用，也能夠同時發生，如14-3-3 蛋白與Bad 結合后，一方面使Bad 與Bcl-2/Bcl-xL 分離，促使其從細胞線粒體轉運到細胞漿，另一方面又可保護其免受鈣調磷酸酶的水解作用[18]。

圖4 純化的GST-14-3-3σ融合蛋白的SDS-PAGE分析

圖5 GST pull-down實驗檢測14-3-3σ和AKT蛋白的相互作用

AKT 又稱蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與腫瘤的發生、發展、轉移及預后密切相關。有實驗報道，14-3-3σ可負調控AKT 進而影響細胞的成瘤性[19]。AKT/PKB是Bad（Bcl-xL/Bcl-2-assosiated death promotor）強有力的激酶，活化的AKT 能在體外使Bad 中與14-3-3 蛋白結合相關的S112 或S136 位點磷酸化[20]，導致14-3-3 蛋白與Bad 結合進而抑制細胞凋亡。本實驗主要利用AKT 與14-3-3 蛋白的體外相互作用證實了融合蛋白14-3-3的生物學活性。

綜上所述，我們用原核表達系統獲取并純化得到GST-14-3-3σ融合蛋白，用GST pull-down 技術檢測了目的蛋白的生物學活性，為后續深入研究14-3-3σ蛋白在調控細胞周期運行、蛋白質相互作用、細胞凋亡及腫瘤生長擴散通路中的作用奠定了實驗學基礎。

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