敲低CTCF腺病毒表達載體的構建及效果檢測

王天藝，張彥，師明磊，趙志虎

軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071

CCCTC 結合因 子（CCCTC binding factor，CTCF，又稱11-鋅指蛋白）是一種進化上高度保守、廣泛表達的多功能鋅指蛋白，其與靶順式元件的結合可阻斷增強子和啟動子的相互作用，是脊椎動物中惟一的絕緣子調節蛋白[1-2]。CTCF 參與很多細胞生物學過程，包括轉錄調控、絕緣活性、V（D）J重組、RNA 剪接和染色質結構調控[1-3]等。CTCF 作為一個廣泛表達的絕緣子調節蛋白，對基因表達和遠距離的染色質相互作用具有重要作用[3-5]。通過11 個鋅指的不同組合，CTCF識別眾多不同的靶標。通過自身的多聚化、多種翻譯后修飾，或者與Cohesin、Suz2、YY1 等不同蛋白互作，介導廣泛的染色質相互作用，作為基因組高級結構的主要組織者發揮眾多不同的功能[6-7]。其異常與前列腺癌、乳腺癌、Wilmington腫瘤等的發生密切相關[8]。據報道，CTCF能與成視網膜細胞瘤發生相關基因Rb2/p130 啟動子區結合，形成特定的構象以維持其轉錄活性，而加速肺癌的進展或有利于腫瘤的復發[9]。另外發現在幾種肺癌細胞中，CTCF敲低后能引起端粒酶逆轉錄酶催化亞單位（TERT）的表達水平也降低，通過依賴于CTCF的增強子-啟動子相互作用環，CTCF對于維持TERT表達起到重要作用，因而有利于細胞永生化和致癌作用[10]。但關于CTCF 在肺癌發生發展中的具體功能和其發揮功能的分子機制仍然了解不清。

RNA 干擾技術已被廣泛用于基因結構功能和表達調控研究，構建RNA 干擾載體的方法很多，其中腺病毒是一種較為常見且廣泛使用的方法[11]。本研究中，我們構建了腺病毒干擾載體敲低CTCF，為肺癌相關發病機制和治療的研究奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎上皮細胞HEK293 細胞（ID：CRL-1573）和人肺腺癌細胞A549 細胞（ID：CCL-185）來自ATCC；人胚腎上皮細胞293A 細胞由本室保存；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京天根生物公司；質粒pSUPERIOR.retro.puro和pAdTrack-CMV 由本室保存；培養基MEM/EBSS、DMEM/High Glucose和DMEM/F-12 1∶1 購自HyClone 公司；OPTI-MEM 購自Gibco公司；LipofectAMIN E2000試劑購自Invitrogen 公司；膠回收、PCR 產物回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自北京天根生物公司；限制性內切酶、連接酶購自TaKaRa公司；反轉錄試劑購自北京壹諾金生物科技有限公司；熒光定量檢測試劑購自南京盛譜基因科技有限公司；兔抗CTCF抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；抗GAPDH兔多克隆抗體和山羊抗兔IgG購自康為試劑公司。

1.2 CTCF小干擾RNA（siRNA）序列設計

CTCF 短發夾RNA（shRNA）1 的上游序列為GC AGAGAAAGTGGTTGGTAAT，下游序列為ATTACC AACCACTTTCTCTGC；CTCF shRNA2 的上游序列為GCGCTCTAAGAAAGAAGATTCCTCT，下游序列為AGAGGAATCTTCTTTCTTAGAGCGC。RT-qPCR 的CTCF 上游引物為5'-ATGTGCGATTACGCCAGTGT A-3'，下游引物為5'-TGAAACGGACGCTCTCCAGT A-3'；GAPDH 上游引物為5'-CATGAGAAGTATGA CAACAGCCT-3'，下游引物為5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'。PCR引物由金維智公司合成。

1.3 CTCF的RNA干擾載體構建

從文獻[12]中獲得CTCF 敲低靶序列，經Blast 比對正確后合成2 對寡核苷酸序列，退火、磷酸化后分別插入pSUPERIOR.retro.puro 載體，PCR 亞克隆H1啟動子表達框，酶切連接到pAdTrack-CMV 載體，電轉BJ5183 感受態細胞，鑒定重組質粒（30 kb），轉染293A細胞，收獲腺病毒。

1.4 293A細胞培養和腺病毒包裝

新復蘇的293A 細胞用含10%胎牛血清的DMEM/High Glucose 培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔3 d換液，將細胞傳至60 mm 培養皿至細胞密度達80%～90%后進行轉染。將1μg 質粒DNA和3μL LipofectAMINE 2000 分別用無血清、無雙抗的Opti-MEM 培養基稀釋，室溫放置5 min，然后將上述2 種液體混勻，室溫放置20 min，加入60 mm 培養皿中，晃動混勻培養液，37℃、5% CO2條件培養5～7 d后收獲病毒。

HEK293細胞的培養同上，培養基換為含10%胎牛血清的MEM/EBSS培養基。

1.5 Western印跡檢測CTCF的表達

將人胚腎HEK293 傳代至生長密度為80%～90%，分別接入包裝好的敲低腺病毒和空白對照GFP 病毒，于培養箱中培養，期間用熒光倒置顯微鏡觀察病毒感染比例；2～3 d 后收獲細胞，加入RIPA細胞裂解液，收獲蛋白；BCA定量后取適量蛋白加入SDS上樣緩沖液，煮沸5～10 min，離心后取上清進行SDS-PAGE；電泳結束后轉至硝酸纖維素膜，用含5%牛奶的TBST 封閉1 h，加入抗CTCF 多克隆抗體（1∶500 稀釋），4℃孵育過夜；用1×TBST 洗5 次，每次6 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶3000 稀釋），室溫孵育1 h；用1×TBST 洗5 次，每次6 min，加入底物發光液進行曝光顯影。

1.6 RT-PCR檢測CTCF的表達

分別收集感染細胞，加入TRIzol 試劑提取總RNA后定量，取1μg RNA 進行反轉錄，參照試劑說明合成第一條cDNA鏈，以其為模板，用RT-qPCR儀進行實時定量，收集熒光信號并檢測實驗組和對照組中相關基因的表達，分析各組擴增的Ct 值和相對表達豐度。

1.7 A549細胞培養、腺病毒感染和CTCF的檢測

將A549 細胞復蘇于含10%胎牛血清的DMEM/F-12 1∶1 培養基中，于37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔3 d 換液，待細胞生長狀態良好，將細胞傳代于六孔板，待細胞生長密度達到約80%，分別感染腺病毒和GFP 空白對照病毒，2～3 d 后，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率并收集細胞。

Western 印跡和RT-PCR 檢測CTCF 的表達方法同上。

2 結果

2.1 CTCF shRNA腺病毒載體的構建

將合成的2 對寡核苷酸序列分別進行退火、磷酸化后，連接pSUPERIOR.retro.puro 載體，轉化后挑克隆提質粒，經SmaⅠ酶切應產生3 條帶，分別為1000、1750、3600 bp（圖1），電泳顯示完全正確；質粒測序結果表明CTCF shRNA 已插入載體且序列與預期完全一致（圖2）。PCR亞克隆H1啟動子表達框后連接到pAdTrack-CMV 載體，電轉BJ5183 感受態細胞獲得正確的重組質粒（30 kb），此重組質粒在293A細胞中將包裝為表達CTCF shRNA的腺病毒。

2.2 利用HEK293 細胞檢測CTCF shRNA 對CTCF的抑制效果

CTCF shRNA 腺病毒包裝完成后，在HEK293細胞中分別感染CTCF shRNA和空白對照GFP 病毒，2～3 d 后分別收獲細胞蛋白和提取RNA。蛋白SDS-PAGE 及Western 印跡結果顯示，與對照GFP 腺病毒組相比，表達CTCF shRNA 的2 個試驗組蛋白水平都明顯降低（圖3）。對RNA 進行RT-qPCR 檢測，發現CTCF shRNA1、shRNA2 號片段都能較好地抑制CTCF 的轉錄水平。說明這2 株表達CTCF shRNA 的腺病毒在蛋白和mRNA 水平上都具有較好的抑制效果。

圖1 CTCF shRNA片段與pSUPERIOR.retro.puro載體連接后經SmaⅠ酶切產物的電泳圖譜

圖2 CTCF shRNA重組質粒的測序結果

2.3 在A549 細胞中驗證CTCF shRNA 腺病毒對CTCF的蛋白和基因轉錄水平的抑制效果

在含有內源性CTCF 的人肺腺癌A549 細胞中，分別轉染CTCF shRNA和空白對照GFP 病毒后，收獲蛋白和RNA 進行檢測。Western 印跡和RT-PCR結果表明，與空白對照相比，感染了CTCF shRNA 腺病毒的A549 細胞中CTCF 的蛋白表達（圖5）和RNA水平（圖6）都明顯降低，且shRNA1 的效應更明顯。說明構建的2株CTCF shRNA腺病毒均有效。

3 討論

圖3 Western印跡檢測HEK293細胞中CTCF shRNA的敲低效果

圖4 RT-qPCR檢測HEK293細胞中CTCF shRNA的敲低效果

圖5 Western印跡檢測A549細胞中CTCF shRNA的敲低效果

圖6 RT-qPCR檢測A549細胞中CTCF shRNA的敲低效果

CTCF 是一種進化上高度保守的多功能鋅指蛋白，在不同細胞中廣泛表達且結合位點眾多[13]，并通過調節多種靶蛋白和基因的增強或絕緣作用而發揮重要。據現有報道，CTCF的異常與多種腫瘤發生和生理異常緊密相關。肺癌作為全世界尤其是我國的高發腫瘤疾病之一，了解其發生發展的分子機制和關鍵調控因子，尋找合適的控制手段和治療靶標，對于有效預防和控制其發生和惡化尤其重要。在本研究中，我們構建了2 個CTCF shRNA 表達腺病毒載體，其中shRNA1 的效果更為明顯。這將為研究和比較CTCF敲低前后，肺癌中關鍵調控因子和蛋白的表達變化、細胞內染色體構象改變及肺癌細胞的永生和致癌能力變化等提供重要手段，有利于探討肺癌發生發展的具體機制并進一步尋求控制肺癌進展的有效手段。

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