表達小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的重組非復制型痘苗病毒的構建及鑒定

龐聰，任皎，趙莉，陽靜，王平興，阮力，譚文杰，田厚文

中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所病毒病應急技術中心，北京 102206

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）是一種白細胞生長因子，它能刺激干細胞向粒細胞和單核細胞的方向分化，因此，人們常利用病毒載體表達GM-CSF，使其發揮佐劑的作用提高免疫效果，而該領域的許多研究都表現出較好的前景[1-3]。比如，最近Bramante 等報道了一種表達GM-CSF 的不同血清型嵌合腺病毒在人體模型中的肉瘤治療效果，治療前12 位病人疾病均在進展中，治療后其中2 位病情部分緩解，4 位病情穩定，只剩一半病人（6 位）疾病仍在進展中[1]。另一些表達GM-CSF 的單純皰疹病毒（HSV）和痘苗病毒的研究也取得較好的治療效果，這些研究還進一步提示，免疫治療效果的提高似乎與表達的GM-CSF本身介導的腫瘤破壞有關[2]。

痘苗病毒表達系統是廣泛使用的真核表達系統，它有長期人體應用歷史，病毒在胞漿中復制，無致癌風險，細胞嗜性廣泛，可插入大的基因片段（至少25 kb），接種后可引發持久的針對外源抗原的中和抗體和毒性T 細胞反應[4-5]。非復制型痘苗病毒天壇株是將痘苗病毒天壇株C、K片段間的與宿主范圍和毒力相關基因缺失而成，與原天壇株痘苗病毒相比，它的毒力明顯下降，不能在人源細胞中有效繁殖，不產生或僅產生極低滴度的子代病毒，卻保留了與原天壇株痘苗病毒相近的DNA 復制、RNA 轉錄與蛋白質翻譯功能[6]。

我們注意到GM-CSF 有很強的種屬特異性。成熟小鼠GM-CSF的氨基酸序列與犬、貓、人和豬GMCSF 有49%～54%的一致性，與大鼠GM-CSF 有69%的一致性[7-8]。而GM-CSF的活性在人和鼠中也存在種屬特異性，小鼠GM-CSF 對大鼠細胞只有微弱活性，而大鼠GM-CSF 對小鼠細胞有全部活性[9-10]。因此，為了在小鼠腫瘤模型中準確評價GM-CSF 作為佐劑對病毒載體抑瘤效果的影響，我們選擇小鼠GM-CSF作為目的基因。

在本研究中，我們以我國具有自主知識產權的非復制型痘苗病毒天壇株為載體，表達有生物學活性的小鼠GM-CSF，為GM-CSF 作為非復制型病毒病毒載體疫苗佐劑的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

8 日齡SPF 級雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；FDC-P1細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心；大腸桿菌DH5α和非復制型痘苗病毒天壇株（NTV）由本實驗室保存；小鼠GM-CSF（GI：145301581）基因來自GenBank，本研究采用該基因290～715 bp 的編碼序列，共426 bp；pJSBH6LacZ 為H6 啟動子帶有LacZ基因的痘苗病毒重組質粒，由本科室前期構建。

限制性內切酶購自NEB 公司；脂質體轉染所用LipofectAMINE 2000 購自Invitrogen 公司；Taq酶（含dNTP和緩沖液）購自TaKaRa 公司；羊抗鼠GM-CSF抗體購自Santa Cruz 公司；驢抗羊紅外標記抗體購自LI-COR Biosciences 公司；小鼠GM-CSF 標準品購自R&D公司。

1.2 小鼠GM-CSF基因的合成

從GenBank 下載小鼠GM-CSF 基因序列（426 bp），在其5'和3'端都加上GGATCC 序列（BamHⅠ酶切位點），然后送公司合成，將合成的基因插入pUC18載體的BamHⅠ酶切位點，得到的質粒命名為pMDGMCSF。

1.3 重組痘苗病毒表達質粒pJSB75GMCSFH6LacZ的構建

用BamHⅠ將pMDGMCSF 中的小鼠GM-CSF 基因切下作為目的基因片段，用BamH Ⅰ將pJSBH6LacZ 酶切作為載體，將二者用快速T4DNA連接酶連接，然后轉染大腸桿菌篩選單斑菌落。通過小提酶切鑒定及測序確定正向插入目的基因的質粒，經37℃過夜培養陽性菌株后大提質粒，-20℃保存備用。

1.4 重組痘苗病毒rNTVGMCSFLacZ的構建

用非復制型痘苗病毒天壇株0.1 PFU/細胞感染70%～90%成片的雞胚成纖維細胞（CEF），33℃吸附2 h 后，將14.4μg pJSB75GMCSFH6LacZ 用LipofectAMINE 2000試劑轉染CEF，33℃孵育3 d，-70℃反復凍融3 次，作為重組病毒液；將重組病毒液用CEF 于33℃孵育3 d，用含2%中性紅和1‰ X-Gal的營養瓊脂鋪斑，利用重組病毒攜帶的藍色標記挑出藍病毒斑，于-70℃反復凍融3 次后繼續染毒，如此連續單斑純化4代，獲得重組病毒。

1.5 rNTVGMCSFLacZ的PCR鑒定

用0.1 PFU/細胞的重組病毒感染CEF，33℃孵育3 d，用DNeasy Blood&Tissue 試劑盒（QIAGEN 公司）提取病毒DNA，然后以P7.5-1（5'CACTAATTCC AAACCCACCC3'）和GMCSF（R）（5'ATCCGCATAG GTGGTAACTTGTGT3'）分別作為上、下游引物對病毒DNA 進行PCR 擴增（擴增循環參數：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 min，30 個循環；72℃延伸10 min）。取PCR 擴增產物進行DNA 電泳，同時將上述引物和PCR 擴增產物各10μL送擎科公司測序，鑒定PCR擴增產物序列。

1.6 rNTVGMCSFLacZ的Western印跡

以10 PFU/細胞的rNTVGMCSFLacZ 感染成片的CEF，24 h 后將5 mL 培養液超濾濃縮至1/10，取100μL 加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，作為培養液樣品；將細胞用冰冷的PBS 洗2 次后刮下離心，收獲的細胞沉淀用100μL SDS-PAGE 上樣緩沖液重懸，作為細胞樣品；將樣品煮沸3～5 min 后離心，取上清25μL 進行15%的SDS-PAGE，將蛋白電轉移到硝酸纖維素膜，以羊抗鼠GM-CSF抗體（1∶200稀釋）為一抗、驢抗羊紅外標記抗體（1∶5000 稀釋）為二抗，用Odyssey紅外掃描儀檢測發光信號。

1.7 小鼠GM-CSF的生物學活性檢測

將傳代的FDC-P1細胞用Hank's液洗3次，用含10%胎牛血清的改良RPMI 1640培養基稀釋后接種96 孔板，每孔1×104細胞，再加入rNTVGMCSFLacZ感染CEF 的培養基上清100μL，同時設小鼠GMCSF 標準品（50 ng/mL）作為陽性對照孔，rNTVLacZ感染CEF 的培養基上清作為陰性對照孔，均加入100μL。每天在顯微鏡下觀察記錄細胞生長情況。

2 結果

2.1 小鼠GM-CSF基因的合成

小鼠GM-CSF 基因序列（426 bp）由公司合成，將合成的基因插入pUC18 載體的BamHⅠ酶切位點，得到質粒pMDGMCSF，測序結果表明小鼠GMCSF基因序列與設計相符。

2.2 小鼠GM-CSF重組痘苗病毒質粒的構建和鑒定

將pMDGMCSF 中的小鼠GM-CSF 基因酶切回收，插入pJSBH6LacZ 的7.5 啟動子下，經酶切電泳后，出現條帶的數目和大小與預期相符，測序結果也表明目的基因序列與設計相符。將構建的質粒命名為pJSB75GMCSFH6LacZ（圖1）。

2.3 表達小鼠GM-CSF 的重組非復制型痘苗病毒rNTVGMCSFLacZ的構建和鑒定

為了獲得表達小鼠GM-CSF 的重組非復制型痘苗病毒，首先用質粒pJSB75GMCSFH6LacZ和非復制型痘苗病毒天壇株在TK區進行同源重組，將質粒中7.5 啟動子下的小鼠GM-CSF 基因和H6 啟動子下的LacZ 基因同源重組到NTV 的TK 區J片段中，然后利用重組病毒攜帶的藍色篩選標記連續單斑純化4 代后，將獲得的重組病毒命名為rNTVGMCSFLacZ，其結構如圖2所示。

將病毒DNA進行PCR擴增，其產物進行DNA電泳，以rNTVLacZ（一株非復制型痘苗病毒，J 片段中插入LacZ 基因）作為陰性對照，電泳結果（圖3）顯示擴增出的片段與預期504 bp 相符，測序結果也顯示小鼠GM-CSF基因的序列正確。

將病毒蛋白用抗羊抗鼠GM-CSF 抗體進行Western 印跡，以小鼠GM-CSF 標準品和rNTVLacZ分別作為陽、陰性對照。Western 印跡結果（圖4）顯示，在病毒培養上清中出現相對分子質量（Mr）約17×103的蛋白，與理論預測的小鼠GM-CSF 的Mr（16×103）接近，證明rNTVGMCSFLacZ 在雞胚細胞中能夠分泌表達小鼠GM-CSF；在病毒感染細胞中未檢測到目的蛋白。

以上PCR 鑒定和Western 印跡結果表明，rNTVGMCSFLacZ 中正確插入了小鼠GM-CSF 基因，且該病毒在雞胚細胞中能分泌表達小鼠GM-CSF。

2.4 rNTVGMCSFLacZ 表達的小鼠GM-CSF 的生物學活性檢測

FDC-P1 細胞是一株IL-3 或小鼠GM-CSF 依賴的骨髓細胞系[11]，因此可以用rNTVGMCSFLacZ 感染CEF 的培養基上清培養FDC-P1 細胞，根據它的增殖情況反映rNTVGMCSFLacZ 是否能分泌有生物學活性的小鼠GM-CSF。

從培養0和2 d時各孔細胞狀況的照片可知，培養2 d 時（圖片未顯示），rNTVGMCSFLacZ 感染CEF的培養基上清孔和小鼠GM-CSF 標準品孔中的細胞密度明顯高于rNTVLacZ 感染CEF的培養基上清孔，100 倍放大視野下的照片（圖5）從局部更清楚地顯示了這種細胞密度差異和細胞活性狀態，而開始培養時（圖片未顯示）各孔中細胞數大致相同。以上結果說明，rNTVGMCSFLacZ 能夠分泌有生物學活性的小鼠GM-CSF。

3 討論

GM-CSF 是分泌型蛋白，較早表達GM-CSF 的研究都在細胞培養上清中檢測GM-CSF[12-13]，而本研究也是在病毒感染細胞上清而非病毒感染細胞中檢測到目的蛋白，與之前的報道一致。另外，我們檢測到的目的蛋白比小鼠GM-CSF 標準品（Mr為14×103）略大，可能與本研究所用的小鼠GM-CSF 標準品是大腸桿菌原核系統表達，而病毒載體表達的小鼠GM-CSF 是真核系統表達，因不同系統加工修飾方式造成了小鼠GM-CSF 大小的差異，根據基因大小，理論推測的小鼠GM-CSF的Mr為16×103。

圖1 pJSB75GMCSFH6LacZ的結構示意圖和酶切電泳圖

圖2 rNTVGMCSFLacZ的結構和引物位置簡圖

圖3 rNTVGMCSFLacZ的PCR鑒定結果

圖4 rNTVGMCSFLacZ表達小鼠GM-CSF的Western印跡

圖5 培養2 d時100倍放大視野下各孔中的細胞狀況

目前，我們僅通過FDC-P1 細胞培養方法初步檢測了rNTVGMCSFLacZ 分泌表達的小鼠GM-CSF的生物學活性，下一步考慮用MTT 法對小鼠GMCSF的表達水平進行定量。

獲得能分泌表達有生物學活性的小鼠GM-CSF的重組非復制型痘苗病毒rNTVGMCSFLacZ后，我們將使之與其他腫瘤治療性疫苗，如表達宮頸癌腫瘤靶抗原HPV16E6、E7的重組非復制型痘苗病毒疫苗[14]或HPV16L2E6E7 融合蛋白疫苗[15]聯合免疫小鼠，評價rNTVGMCSFLacZ作為佐劑的效果，以及其在不同劑量下對小鼠免疫反應的影響，同時與原核表達的GM-CSF 作為佐劑進行對比分析，探討細胞因子在體內表達作為腫瘤免疫治療佐劑的應用前景。

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