利用合成的基因回路實現細胞水平上尿酸穩態控制的實驗研究

曲國龍 ，邵妤，2，譚俊杰，陳章，金晶，4，凌焱，李玉霞，劉剛，陳惠鵬

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；2.安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230039；3.成都軍區總醫院 呼吸科，四川 成都 610083；4.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016

合成生物學（synthetic biology）是后基因組時代的新興學科，同時也是現代生命科學研究的熱點領域[1]。合成生物學新在“合成”二字，亦即一個再創造的過程，旨在以傳統的生物學技術為基礎，結合工程學、材料學、計算科學等其他學科的技術方法進行人工定向創造[2-3]。其涵蓋的研究內容可大體分為3 個層次[4]：一是利用已知功能的天然生物模體（motif）或模塊（module）構建新型調控網絡并表現出新功能；二是采用從頭合成（de novosynthesis）的方法，人工合成基因組DNA 并重構生命體；第三個層次則是在前兩個研究領域得到充分發展之后，創建完整的全新生物系統乃至人工生命體（artificial life）。

近20 年來，合成生物學研究取得了長足進展。2000 年，《Science》發文報道了2 個人工合成的基因網絡基因震蕩器（oscillator）[5]和基因開關（toggles witch）[6]；2002 年，Wimmer[7]研究組在歷史上首次合成具有生物活性的脊髓灰質炎病毒基因組；2010 年5 月20 日，Venter[8]研究組通過將人工合成的支原體基因組移植到山羊支原體細胞，創造了首個僅由人造基因組控制的活細胞。這些具有里程碑意義的研究，充分體現了合成生物學廣闊的前景及潛在的應用價值。比如，Keasling[9]等合成抗瘧藥物青蒿素和Voigt[10]等通過人工改造的細菌進行抗癌等經典研究工作，皆顯示了合成生物學在生物醫藥領域的廣泛應用。

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤代謝的終產物，微溶于水，易形成尿酸鹽晶體沉淀，長期的高尿酸血癥易引發痛風。有文獻報道，耐輻射異常球菌中，基因hucR編碼的蛋白HucR 在尿酸介導下，可以與基因hucO產生相互作用[11-12]，其作用原理是當尿酸濃度低于某一值時HucR 與hucO相結合，對hucO下游基因的表達產生抑制作用；當尿酸濃度高于某一值時，HucR 與hucO分離，hucO下游基因正常表達。2010年，有研究人員通過合成的基因回路實現了小鼠體內尿酸的穩態控制[13]。在本研究中，我們以mUTs（連有KRAB 結構域的hucR基因）和hucO8（hucO的8串聯結構）為基礎，分別構建雙載體基因回路和雙向共表達單載體基因回路，進一步研究分析細胞水平上回路對尿酸的感應及調控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa 細胞、載體pcDNA3.1/V5-His（C）由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α化學感受態購自北京博邁德科技發展有限公司；載體pSEAP2-control 購自Clontech 公司；載體pBudCE4.1、轉染試劑LipofectAMINE 2000和Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit 均購自Invitrogen 公司；dNTP、限制性內切酶、T4DNA 連接酶均購自NEB 公司；DNA marker購自Trans和TaKaRa公司；質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司；LATaqDNA 聚合酶購自TaKaRa 公司；報告基因SEAP檢測試劑盒購自TOYOBO 公司；DMEM 培養基、Opti-MEM 培養基、胎牛血清均購自GIBCO 公司；DMSO 購自Sigma 公司；胰蛋白酶購自HyClone 公司；24 孔和96 孔細胞培養板購自Costar 公司；尿酸干粉購自ACROS 公司；DNA 合成和測序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 mUTs及hucO8的合成

從NCBI 網站獲 取mUTs及hucO8的序列，在mUTs的5'和3'端分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，hucO8的5'和3'端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點，人工合成2 段基因序列并連接至pMD18T 載體，分別命名為pMD18T-mUTs和pMD18T-hucO8。

1.3 mUTs基因的改造

通過PCR 在mUTs的5'端引入NotⅠ位點，3'端引入BglⅡ位點。用Primer Premier 5 設計PCR 上游引物P1（5'-GCGGCCGCGAATTCATGGATGCTA AGTCACTAA-3'，下劃線序列為NotⅠ位點）和下游引物P2（5'-AGATCTTCTAGATTATACCCCCTGCTC CAGCCC-3'，下劃線序列為BglⅡ位點）。PCR 模板為pMD18T-mUTs，PCR 擴增體系（25μL）包括DNA模板100 ng、LATaq（5 U/μL）酶0.3μL、引物（100μmol/L）各1μL、5×GC 緩沖液5μL、dNTP（2.5 mmol/L）4μL，用ddH2O 補至25μL。PCR 擴增程序：94℃預變性5 min，然后以94℃變性30 s、65℃退火1 min、72℃延伸1 min 擴增30 個循環，72℃延伸5 min。回收目的產物連接至pMD18T 載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，振蕩培養后提取質粒，酶切及測序鑒定，將陽性克隆命名為pT-NmUTsB。

1.4 載體pSEAP-hucO8的構建

以pMD18T-hucO8和pSEAP2-control 為基礎載體，用HindⅢ/EcoRⅠ對載體分別進行雙酶切，2%和1%的瓊脂糖凝膠電泳分別分離回收pMD18T-hucO8小片段及pSEAP2-control 大片段，用T4DNA 連接酶連接2個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

1.5 轉錄抑制物表達載體pcDNA3.1/V5-mUTs的構建

以pMD18T-mUTs和pcDNA3.1/V5-His（C）為基礎載體，用EcoRⅠ/NotⅠ對載體分別進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pMD18T-mUTs 小片段及pcDNA3.1/V5-His（C）大片段，用T4DNA 連接酶連接2個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

1.6 雙向共表達載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs 的構建

首先構建pBudCE4.1-SEAP。以pBudCE4.1和pSEAP-hucO8為基礎載體，用HindⅢ/SalⅠ對載體分別進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pSEAP-hucO8小片段（hucO8-SEAP）及pBudCE4.1 大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

以pBudCE4.1-SEAP和pT-NmUTsB 為基礎載體，用NotⅠ/BglⅡ對載體分別進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pT-NmUTsB 小片段及pBudCE4.1-SEAP 大片段，用T4DNA 連接酶連接2個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

1.7 載體phucO8-smUox的構建

從NCBI 網站獲取smUox序列，人工合成該基因序列并連接至pGH 載體，命名為pGH-smUox。以pSEAP-hucO8和pGH-smUox 為基礎載體，用EcoRⅠ/XbaⅠ對載體分別進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pGH-smUox 小片段及pSEAP-hucO8大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

1.8 單載體UA 調控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox的構建

首先構建載體pBudCE4.1-smUox。以載體phucO8-smUox和pBudCE4.1 為基礎載體，用Hind Ⅲ/BamHⅠ對載體分別進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收phucO8-smUox 小片段（hucO8-smUox）及pBudCE4.1 大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

然后以pBudCE4.1-smUox和pBudCE4.1-SEAP-mUTs為基礎載體，用NotⅠ/BglⅡ對載體分別進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pBudCE4.1-SEAP-mUTs 小片段及pBudCE4.1-smUox 大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個目的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑取單菌落，培養后提取質粒，酶切鑒定。

1.9 HeLa細胞培養及轉染

HeLa 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基在37℃、5% CO2的培養箱中培養。細胞復蘇后傳代2～3次，至細胞狀態良好時進行轉染；轉染前24 h接種HeLa 細胞到24 孔細胞培養板中，每孔約1.0×105細胞，以保證轉染時細胞融合度達到90%左右。轉染步驟詳見LipofectAMINE 2000說明書。

1.10 報告基因SEAP檢測

用Reporter Assay Kit（-SEAP-）在Enspire Multilabel Reader（Perkin Elmer）上檢測分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）的表達量。瞬時轉染檢測時間為24～48 h，SEAP 的表達是一個持續的過程，48 h 后表達量相對較大，檢測結果相對較好。具體步驟詳見試劑盒說明書。

1.11 20 mmol/L尿酸溶液的配制

配制100 mL 50 mmol/L（pH10.0）的Tris-HCl溶液，稱取336 mg UA 粉末，倒入Tris-HCl 溶液中，攪拌至UA粉末完全溶解，用0.22μm的一次性過濾器過濾后用于細胞轉染實驗。

1.12 尿酸及尿酸酶檢測

轉染后48 h，用Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit 在Enspire Multilabel Reader 上檢測尿酸及尿酸酶含量，檢測波長560 nm。具體步驟詳見試劑盒說明書。

2 結果

2.1 載體pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs 的構建

挑取構建后載體的單克隆，用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，結果如圖1A，250 bp 偏上條帶與目的片段（274 bp）相符，說明載體pSEAP-hucO8構建成功。

挑取構建后載體的單克隆，用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，結果如圖1B，1000 bp 處出現條帶，與目的片段（974 bp）相符，說明載體pcDNA3.1/V5-mUTs構建成功。

2.2 載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs的構建

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產物，結果如圖2A，1000 bp 處出現目的條帶；目的條帶連接至pMD18T 載體，用NotⅠ/BglⅡ雙酶切，電泳結果如圖2B，部分樣品出現目的條帶，測序分析出現目的條帶的單克隆樣品，結果正確，說明在mUTs的5'和3'端成功引入NotⅠ和BglⅡ位點。挑取構建的pBudCE4.1-SEAP 單克隆，用HindⅢ/SalⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2C，2000 bp 偏上出現條帶，與目的片段（2301 bp）相符，說明載體pBudCE4.1-SEAP 構建成功。挑取構建的pBudCE4.1-SEAP-mUTs 單克隆，分別用HindⅢ/SalⅠ和NotⅠ/BglⅡ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2D，3 個單克隆樣品均出現與2 個目的片段大小相符的條帶，說明載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs構建成功。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定pSEAP-hucO8（A）和

2.3 單載體UA 調控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox的構建

挑取phucO8-smUox 載體單克隆，用EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3A，1000 bp 處出現條帶，與目的片段（985 bp）相符，說明載體phucO8-smUox 構建成功。挑取pBudCE4.1-smUox 載體單克隆，用HindⅢ/BamHⅠ雙酶切，結果如圖3B，1500～2000 bp 間出現條帶，與目的片段（1755 bp）相符，說明pBudCE4.1-smUox 構建成功。以NotⅠ/BglⅡ為酶切位點，在pBudCE4.1-smUox 載體上連入mUTs，完成載體pBudCE4.1-mUTs-smUox的構建。用HindⅢ/BamHⅠ和NotⅠ/BglⅡ分別進行雙酶切，結果如圖3C，出現2 個與目的片段（985、1755bp）相符的條帶，且大片段正確，說明載體pBudCE4.1-mUTs-smUox構建成功。

2.4 雙載體基因回路基本功能驗證

圖2 載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs構建的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果

圖3 載體pBudCE4.1-mUTs-smUox構建的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

以不同濃度LipofectAMINE 2000 轉染pSEAPhucO8（每孔0.8μg）至HeLa 細胞，轉染48 h 后收集細胞培養基上清進行SEAP化學發光強度檢測，結果如圖4A，隨著LipofectAMINE 2000 濃度的提高，SEAP 的表達量增加，說明pSEAP-hucO8轉入細胞后SEAP基因可以正常表達。以不同摩爾比共轉染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8（固定每孔0.8μg），2 種質粒與LipofectAMINE 2000 分別稀釋、混合，轉染時每孔各加入100μL 混合液，轉染6 h 后換液，轉染48 h后檢測，結果如圖4B，相比于單獨轉染pSEAP-hucO8，共轉染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8時，SEAP 化學發光強度顯著降低，且隨著mUTs/hucO8比例的提高，SEAP發光強度逐漸緩慢降低。說明mUTs可以正常表達且能與hucO8結合并抑制下游基因表達，隨著mUTs/hucO8摩爾比的提高，抑制作用增強。

2.5 單載體回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs 基本功能驗證

以不同濃度的LipofectAMINE 2000 轉染pBudCE4.1-SEAP（每孔1.0μg）至HeLa 細胞，轉染48 h 后收集細胞培養基上清進行SEAP 化學發光強度檢測，結果如圖5A，隨著LipofectAMINE 2000 濃度的提高，SEAP 化學發光強度增強，說明pBudCE4.1-SEAP 轉入細胞后SEAP基因可以正常表達；然后分別以不同摩爾比轉染pBudCE4.1-SEAP-mUTs（每孔1.2μg）和pcDNA3.1/V5-mUTs，轉染48 h后檢測SEAP化學發光強度，結果如圖5B，實驗組相比于陰性對照組SEAP 化學發光強度明顯降低，且mUTs/hucO8比例越高，發光強度越低。說明pBudCE4.1-SEAP-mUTs 載體上mUTs可以正常表達且能與hucO8結合并對下游基因表達起到一定的抑制作用，且mUTs/hucO8比例越高，抑制作用越明顯。cO8/mUTs=1∶4。

2.6 回路對尿酸感應作用分析

通過檢測不同濃度尿酸培養時SEAP 的表達量來驗證回路對尿酸的感應作用。以4∶1 的比例共轉染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8或者單獨轉染pBudCE4.1-SEAP-mUTs，轉染6 h 后換液并添加不同濃度的UA，轉染48 h 后檢測SEAP 化學發光強度。共轉染結果如圖6A，0～0.3 mmol/L 范圍內SEAP 化學發光強度基本不變，0.4～2.0 mmol/L 范圍內SEAP 化學發光強度明顯增強，但變化不大；單獨轉染pBudCE4.1-SEAP-mUTs 結果如圖6B，0～2.0 mmol/L 范圍內SEAP 化學發光強度逐漸增強，且變化明顯。結果表明，雙載體回路和單載體回路均具有一定的尿酸感應能力，單載體回路在0～0.3 mmol/L 尿酸濃度范圍內感應作用不明顯，0.4～2.0mmol/L范圍內感應作用明顯，但變化不大；單載體回路在0～2.0 mmol/L 范圍內對UA 的感應作用逐漸增強且變化明顯。

圖4 雙載體基因回路基本功能驗證（SEAP化學發光強度檢測）

圖5 單載體回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs基本功能驗證（SEAP化學發光強度檢測）

2.7 回路對尿酸調控作用分析

單獨轉染pBudCE4.1-smUox，檢測smUox能否在HeLa 細胞中正常表達，轉染48 h 后檢測培養基中尿酸酶的含量，結果如圖7A，隨著pBudCE4.1-smUox 濃度的提高，培養基中尿酸酶含量逐漸增加。設計不同的分組實驗，檢測回路對尿酸的調控作用，轉染6 h 后換液，每孔加入500μmol/L 尿酸，轉染48 h后檢測培養基中的UA含量，結果如圖7B，與陰性對照相比，實驗組培養基中UA濃度均有所下降。最后以3∶1 的摩爾比共轉染pcDNA3.1/V5-mUTs和pBudCE4.1-mUTs-smUox，轉染6 h后換液，分別添加不同濃度的UA，轉染48 h 后檢測培養基中的UA 濃度，以此檢驗回路對UA 的調控能力及調控范圍，結果如圖7C，0～300μmol/L 范圍內尿酸濃度基本不變，500～2000μmol/L 范圍內尿酸濃度均有所下降，且初始濃度越高，下降幅度越大。綜合分析表明，smUox轉染HeLa 細胞后可以正常表達并具有活性；單載體回路及雙載體回路均具有一定的尿酸調控能力，且尿酸調控能力相當；當mUTs/hucO8=4∶1 時，回路對尿酸的調控作用略有增強，但變化不大；尿酸濃度為0～2000μmol/L，pcDNA3.1/V5-mUTs 與pBudCE4.1-mUTs-smUox 的摩爾比為3∶1時，0～300μmol/L 范圍內回路對尿酸基本沒有調控作用，500～2000μmol/L 范圍內，隨著尿酸濃度增高，回路的降尿酸作用相對越強。

3 討論

合成生物學作為我國亟待發展的前沿科學正逐步被了解和重視，雖然目前還處于起步階段，但從現有研究成果不難看出，其在生物醫藥、能源、環境污染治理、生物傳感器和軍事等諸多領域具有極好的應用前景。利用已知功能的基因片段，人工合成一些新的基因裝置或調控網絡，從而定向改變哺乳動物細胞的代謝行為，是合成生物學在生物醫藥領域的一個研究熱點。

圖6 回路對尿酸感應作用分析

圖7 回路對尿酸調控作用分析

本研究中，我們合成的基因回路就是利用了耐輻射異常球菌基因組中已知功能的基因hucR及其結合位點hucO。hucR經過起始密碼子優化，連接蛋白結構域形成優化的轉錄抑制物基因mUTs，hucO經過串聯形成結合位點的8串聯結構hucO8，再以mUTs和hucO8為基礎，利用合成生物學的方法，定向構建新的尿酸調控回路。回路發揮功能的前提是：mUTs轉錄翻譯后產生的蛋白mUTS 具有轉錄抑制作用，且mUTS和hucO8在尿酸的介導下可以相互結合或分離。回路的基本原理是：當尿酸低于某一濃度時，mUTS 與hucO8結合，抑制hucO8下游基因的表達；當尿酸高于某一濃度時，mUTS 與hucO8分離，hucO8下游基因正常表達。尿酸酶具有分解尿酸的作用，當我們把尿酸酶基因連入hucO8下游時，回路就可以對周圍環境中不同濃度的尿酸做出相應的應答。當尿酸低于某一濃度時，回路關閉，不發揮調控作用；當尿酸濃度高于某一濃度時，hucO8下游的尿酸酶基因正常表達，從而降低尿酸濃度，當尿酸濃度降低至某一值時，mUTS與hucO8相結合，抑制尿酸酶基因的表達，使尿酸濃度穩定在一定范圍內，從而實現對尿酸的調控。

我們首先利用優化的基因片段mUTs和hucO8完成了載體pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8的構建，組成了雙載體基因回路，通過HeLa 細胞轉染實驗，驗證了mUTs和hucO8在尿酸介導下的相互作用；然后利用基因片段mUTs和hucO8合成了雙向共表達載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs，實現了單載體基因回路的構建，通過細胞轉染實驗，驗證了單載體回路上mUTs和hucO8在尿酸介導下的相互作用；最后通過連入優化的黃曲霉菌尿酸酶基因smUox，構建了單載體尿酸調控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox，通過檢測回路轉染HeLa 細胞后培養基中尿酸濃度的變化，驗證了回路對尿酸的調控作用。我們發現，mUTs與hucO8的比例對回路影響很大，當二者比例為4∶1 時，mUTs對下游基因表達的抑制作用明顯增強，從而影響回路對尿酸的調節范圍及調節程度。鑒于LipofectAMINE 2000 的細胞毒性、轉染效率等因素，我們沒有繼續增大二者比例進行實驗研究。

相比于雙載體基因回路，單載體基因回路具有以下特點：單載體基因回路可以規避轉染效率不定導致的轉入細胞的mUTs和hucO8比例不定的問題，使得mUTs與hucO8可以按照1∶1 的比例轉入細胞；相比于通過共轉染才能實現的基因回路，單載體回路在一定程度上降低了實驗操作的難度；單載體回路在很大程度上簡化了后續研究中穩定轉染細胞系的篩選工作。

我們構建的基因回路也存在一些問題，與預期結果有一些差異。其中比較主要的問題是，單載體和雙載體基因回路對尿酸都具有一定的感應調節作用，但調節作用不夠理想。比如，尿酸濃度為1000～2000μmol/L時，雖然基因回路的降尿酸程度相對較大，但仍不能降至正常生理范圍內。我們雖然發現當mUTs與hucO8比例為4∶1 時對回路會有較大影響，但由于技術上的原因，未能成功構建二者比例為4∶1 的單載體回路，為了達到更好的效果，仍須共轉染pcDNA3.1/V5-mUTs 來提高mUTs的比例。我們通過瞬時轉染的方法驗證了回路對尿酸具有一定的感應及調節能力，但由于沒有進行穩定轉染細胞系的篩選，所以無法對尿酸濃度不斷變化時，回路是否具有可逆性及回路的長期穩定性進行驗證。這些存在的問題仍需要在后續研究中進一步探索解決。

正是合成生物學的興起與發展，才使得我們可以利用已知功能的生物模塊，經過簡單的設計，合成新型調控網絡并使其表現出預期的功能。這種研究方法為一些代謝類疾病的基因及細胞水平上的治療提供了新的思路。相信隨著合成生物學技術的進一步發展，以合成生物學為基礎的相關研究會逐步走向臨床應用、走進生活，在實踐中發揮更大的作用。

[1]樓鐵柱.合成生物學發展回顧與軍事應用前景展望[J].軍事醫學,2011,35(2):81-87.

[2]Kanehisam M.Post-genome informatics[M].New York:Oxford University Press,2000:148.

[3]趙心清,姜如嬌,白鳳武.啟動子和細胞全局轉錄機制的定向進化在微生物代謝工程中的應用[J].生物工程學報,2009,25(9):1312-1315.

[4]凌焱,段海清,陳惠鵬.合成生物學[J].軍事醫學科學院院刊,2006,30(6):572-574.

[5]Elowitz M B,Leibler S.A synthetic oscillatory network of Transcriptional regulators[J].Nature,2000,403(6767):335-338.

[6]Gardner T S,Cantor C R,Collins J J.Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli[J].Nature,2000,403(6767):339-342.

[7]Cello J,Paul A V,Wimmer E.Chemical synthesis of poliovirus cDNA:generation of infectious virus in the absence of natural template[J].Science,2002,297(5883)：1016-1018.

[8]Gibson D G,Glass J I,Lartigue C,et al.Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome[J].Science,2010,329(5987):52-56.

[9]Ro D K,Paradise E M,Ouellet M,et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast[J].Nature,2006,440(7086):940-943.

[10]Levskaya A,Chevalier A A,Tabor J J,et al.Synthetic biology:engineering Escherichia coli to see light[J].Nature,2005,438(7067):441-442.

[11]Wilkinson S P,Grove A.HucR,a novel uric acid-responsive member of the MarR family of transcriptional regulators from Deinococcus radiodurans[J].J Biol Chem,2004,279:51442-51450.

[12]Wilkinson S P,Grove A.Negative cooperativity of uric acid binding to the transcriptional regulator HucR from Deinococcus radiodurans[J].J Mol Biol,2005,350:617-630.

[13]Kemmer C,Gitzinger M,Daoud-EI Baba M,et al.Self-sufficient control of urate homeostasis in mice by a synthetic circuit[J].Nat Biotechnol,2010,28:355-360.