通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除人源PDE10A基因

梁振偉，饒書權(quán)，沈 巖，許 琪

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除人源PDE10A基因

梁振偉，饒書權(quán)，沈 巖，許 琪*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

目的建立敲除基因組中PDE10A基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。方法設(shè)計(jì)3個(gè)長(zhǎng)20bp的sgRNA，分別靶向PDE10A的exon 6、exon 7和exon 11。化學(xué)合成sgRNA寡核苷酸序列，并克隆進(jìn)PX330質(zhì)粒中。將克隆正確的質(zhì)粒PX330-sgRNA轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，提取基因組DNA并對(duì)敲除位點(diǎn)附近的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再通過(guò)SURVEYOR分析和一代測(cè)序?qū)η贸蔬M(jìn)行檢測(cè)。最后采用有限稀釋法挑選穩(wěn)定敲除PDE10A的HEK 293T細(xì)胞株。結(jié)果目的sgRNA 寡核苷酸雙鏈成功插入PX330質(zhì)粒中且序列正確；靶向Exon 7的sgRNA可成功敲除PDE10A，且敲除效率高達(dá)31.4%；穩(wěn)定敲除PDE10A的細(xì)胞株篩選成功，可導(dǎo)致2 bp 缺失。結(jié)論P(yáng)DE10A基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)構(gòu)建成功。

PDE10A；CRISPR/Cas9；穩(wěn)定細(xì)胞株

PDE10A基因編碼一種屬于環(huán)核苷酸磷酸二酯酶家族的蛋白[1]，通過(guò)水解cAMP和cGMP的5′磷酸基團(tuán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的濃度，從而在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。PDE10A主要分布于新紋狀體中具有多巴胺神經(jīng)元活性的中間棘神經(jīng)元[2]，在腦內(nèi)其他組織如海馬、皮質(zhì)及小腦等也有少量表達(dá)[3]。PDE10A表達(dá)量異常升高與多種涉及基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)傳遞的神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)，如精神分裂癥、強(qiáng)迫癥和亨廷頓氏舞蹈病等。當(dāng)使用PDE10A的抑制因子時(shí)，可以在小鼠和恒河猴中產(chǎn)生類似抗精神病藥物的效應(yīng)，改善動(dòng)物的認(rèn)知功能[4]。本研究利用CRISPR/Cas9建立PDE10A基因靶向敲除系統(tǒng)，為研究PDE10A基因的功能和基因敲除干細(xì)胞或小鼠提供一部分研究依據(jù)。……