兩種非病毒載體介導(dǎo)microRNA轉(zhuǎn)染的對比

高 聰，黃 莉，梁 兵，袁 芳，龍友明，鄭揚波，陳夢宇

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1.神經(jīng)科學(xué)研究所； 2.附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510260)

兩種非病毒載體介導(dǎo)microRNA轉(zhuǎn)染的對比

高 聰1，2*，黃 莉1，梁 兵2，袁 芳2，龍友明1，鄭揚波1，陳夢宇1

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1.神經(jīng)科學(xué)研究所； 2.附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510260)

microRNA作為核酸類藥物，在細胞和生物體內(nèi)存在穩(wěn)定性差，半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低，靶向性差[1]，故轉(zhuǎn)染過程需要高效、高安全性的載體。Lipofectamine是常用的轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體，可與DNA形成復(fù)合物，有較強的轉(zhuǎn)染能力。聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine, PEI) 屬陽離子聚合物，在體內(nèi)外均有較高的轉(zhuǎn)染效率，不良反應(yīng)較低[2]。選擇適合的小分子RNA基因載體對其后續(xù)研究至關(guān)重要。本研究分別選擇了脂質(zhì)體lipofectamin2000和陽離子聚合物PEI作為microRNA的轉(zhuǎn)染載體，在體外檢測其在懸浮細胞THP-1中的轉(zhuǎn)染效率和細胞死亡率，比較兩種轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染特性及作為microRNA基因載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料：1)試劑PEI(Sigma公司，408727-100 mL)；has-miR-155 mimics、Hairpin-it miRNAs q-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑盒(invitrogen，lot no.569165)等。2)細胞系：人單核巨噬白血病細胞THP-1(ATCC)。

1.2 方法：1)PEI介導(dǎo)FAM標(biāo)記的microRNA(miR-155 mimics)轉(zhuǎn)染效率評估。2)熒光鏡下觀察microRNA轉(zhuǎn)染效果，取對數(shù)生長期的THP-1細胞以完全培養(yǎng)基在24孔板中培養(yǎng)。實驗分為 4組：①空白組：不加轉(zhuǎn)染試劑，不加miRNA；②空轉(zhuǎn)組：不加轉(zhuǎn)染試劑，只加miRNA；③Lipo組：用Lipofectamine 2000/miR-155復(fù)合物轉(zhuǎn)染；④PEI組：用PEI/miR-155復(fù)合物不同N/P比值(指的是PEI/microRNA復(fù)合物中 PEI分子所含的 N原子與microRNA分子中所含的P原子的摩爾比)轉(zhuǎn)染，比值分為60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1和10∶1組，Lipo/miR-155復(fù)合物以2 μL/20 pmol配得，按說明書操作轉(zhuǎn)染，每組實驗重復(fù)3次。3)轉(zhuǎn)染效率及細胞死亡數(shù)，同上實驗分4組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h，分別以DAPI、PI染色，在熒光鏡下觀察。……