KKAI1／CD82在甲狀腺癌中的表達及臨床意義

田忠成，邵飛飛，黨雪菲 ，邱 實

（吉化集團公司總醫院 化療科，吉林 吉林132021）

甲狀腺癌為較常見的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤1%，嚴重威脅著人類的健康。甲狀腺癌是多因素起源的癌基因和抑癌基因相互失衡導致的疾病。由于甲狀腺腫瘤病程隱匿、進展緩慢，一般良、惡性腫瘤的癥狀和體征也沒有明顯的區別，給臨床診斷治療帶了極大的困難。近年來，國內外研究者研究發現KAI1／CD82與腫瘤進程之間密切相關，可視為新的腫瘤標志物。目前KAI1／CD82在甲狀腺癌中的表達相關性研究尚無文獻報道。

1 材料與方法

1.1 標本選取吉化集團公司總醫院2011－2013年甲狀腺癌手術切除標本35例：按組織學分型隨機選取乳頭狀腺癌（PTC）10例，濾泡狀癌（FTC）13例，髓樣癌（MTC）12例，另選正常甲狀腺組織12例。患者術前均未行放療或化療。收集的所有組織均分成兩份，一部分放入10%中性福爾馬林，常溫下固定用于免疫組織化學染色實驗，一部分保存與－80℃冰箱中，用于組織勻漿后進行RT－PCR檢測。

1.2 試劑與引物 免疫組織化學染色 免疫組化采用SP法?？筀AI1／CD82人單克隆抗體購自Neo marker公司，S－P二抗試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 石蠟切片經脫蠟和梯度復水后，將切片置枸櫞酸鹽修復液中加熱至98℃進行修復；冷卻至40℃以下，滴加3%H2O2室滅活內源性過氧化物酶的活性，用PBS沖洗；滴加正常兔血清封閉液，室溫孵育30min，甩去多余的液體（勿洗）；滴加鼠抗人KAI1／CD82單克隆抗體，4℃過夜，PBS沖洗；滴加二抗，室溫孵育20min，PBS沖洗；滴加三抗，室溫孵育20min，PBS沖洗；3，3－二氨基苯聯胺（DAB）顯色；蘇木素復染；梯度乙醇脫水、二甲苯透明，樹膠封片。用已知KAI1／CD82陽性的甲狀腺癌切片作陽性對照，結果為陽性。用己知KAI1／CD82陰性的乳腺癌切片作陰性對照，結果為陰性。用PBS液代替一抗體作空白對照，結果為陰性。

1.3.2 RT－PCR 按 Trizol試劑操作說明提取RNA，逆轉錄反應按照RT反應試劑盒說明書進行。KAI1／CD82引物：擴增片段長度274bp，上游引物：5’－TGGACTTCTACCTGCCCTCA－3’，下游引物：5’－ACACCATTCTCCTGCCTCA－3’，取PCR反應液10μl進行瓊脂糖凝膠電泳，利用1D KODAK凝膠圖像分析系統攝片。

1.4 結果判定

1.4.1 免疫組織化學 KAI1／CD82的陽性信號主要定位于細胞膜，陽性表達表現為黃色或棕黃色顆粒，胞漿中亦有著色。200倍顯微鏡下每張切片計數5個不同視野，計數每個視野中癌細胞總數及陽性癌細胞數。結果用平均數±標準差（±s）表示。①染色強度：0分為無色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②陽性細胞的百分比：1分為陽性細胞≤10%；2分為11%－50%；3分為51%－75%；4分為＞76%。染色強度與陽性細胞所占百分比的乘積上述2項結果相乘：0分為陰性（－），1－2分為弱陽性（＋），3－6分為中等陽性（＋＋），＞6分為強陽性（＋＋＋）。

1.4.2 RT－PCR陽性條帶判定方法 與 Marker相比較在274bp和616bp處出現陽性條帶者分別判定為KAI1／CD82和GAPDH mRNA陽性表達；如在對應區域未見陽性條帶出現，則判定為陰性。用內參照（GAPDH）光密度值標化KAI1／CD82mRNA的吸光度值，得到KAI1／CD82mRNA表達的相對含量。具體計算公式如下：KAI1／CD82相對含量＝（KAI1／CD82光密度值／GAPDH光密度值）×100。

1.5 統計學處理

所有實驗數據用SPSS16.0統計軟件進行處理，各組間數據比較采用t檢驗或χ2檢驗。計量數據以±s表示。RT－PCR結果以1DKODAK凝膠圖像分析系統檢測灰度值，進行半定量分析，判斷差異顯著性，P＜0.05差異有顯著性，P＜0.01差異有非常顯著性意義，P＞0.05差異無統計學意義。

2 結果

2.1 SP法免疫組織化學染色結果顯示，在10例甲狀腺乳頭狀癌中，8例表達陽性，陽性率為80%。在13例甲狀腺濾泡癌中，7例表達陽性，陽性率53.8%。在12例髓樣癌中，2例表達陽性，陽性率為16.7%。而12例正常甲狀腺組織中，12例均表達陽性，陽性率為100%。根據陽性結果判斷標準，KAI1／CD82在不同組織學分型的甲狀腺癌中表達強度不一樣。統計結果顯示，KAI1／CD82在正常甲狀腺組織中與乳頭狀甲狀腺癌中的表達相比有所下降但差異不明顯（P＞0.05）。濾泡癌及髓樣癌同正常甲狀腺組織相比，KAI1／CD82表達顯著降低（P＜0.05）。在甲狀腺癌中，不同組織學類型的表達具有差異，隨著其組織學惡性度的增強，KAI1／CD82表達降低（表1）。

表1 KAI1／CD82在正常甲狀腺及甲狀腺癌中的表達及其與組織學分型的關系

2.2 RT－PCR檢測 KAI1／CD82基因RT－PCR目的片段長度為274bp。電泳結果顯示，KAI1／CD82基因在所有檢測的甲狀腺癌及正常甲狀腺癌中具有不同程度的表達，在274bp處出現亮帶（圖1）。利用Kodak凝膠成像系統軟件分析各條帶灰度值，并計算目的條帶亮度相對值。統計結果顯示KAI1／CD82基因在甲狀腺乳頭狀癌中的相對表達值為85.406±12.992，在濾泡癌中的相對表達值為70.1±10.880，在髓樣癌中的相對表達值為30.682±13.270，而在正常甲狀腺組織中的相對表達值為91.124±12.292。乳頭狀癌與正常甲狀腺組織相比，KAI1／CD82的表達量有所下降，但不顯著。濾泡癌及髓樣癌同正常甲狀腺組織相比，KAI1／CD82表達量顯著下降（P＜0.05）。隨著甲狀腺癌組織學惡性度的提高，KAI1／CD82基因表達水平呈下降趨勢（圖2）。

圖1 KAI1／CD82mRNA在正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中的表達

圖2 KAI1／CD82mRNA在正常甲狀腺和甲狀腺癌組織中的表達

3 討論

腫瘤的侵襲、轉移是腫瘤患者死亡的主要原因。轉移是惡性腫瘤最重要的特征之一，也是影響患者生命和治療效果的主要原因。有關轉移分子機制的研究表明，這一個多階段復雜過程的每一階段都受著不同因素的影響及相關基因的調控。它們或被激活、或被抑制、相互協同或拮抗，最終影響腫瘤細胞的生物學特性。如癌基因的過度活化、抑癌基因的失活；腫瘤細胞增殖周期的調控；腫瘤細胞凋亡的調控、腫瘤轉移相關因素的調控等等。因此，探討與腫瘤生物學相關的因素，尋找腫瘤預防和治療的有效途徑，是目前腫瘤研究的一項重要課題。

3.1 KAI1／CD82的結構和功能

KAI1／CD82是1995年Dong等從人前列腺癌雜交細胞中克隆分離出來的新的腫瘤轉移抑制基因，屬于 TM4SF（transmembrane4superfamily）家族成員，能與多種轉錄因子結合，調節基因轉錄，影響細胞間及細胞與細胞外基質的信號傳導，參與細胞的增生調節[1]。KAI1／CD82基因位于人染色體11P11.2上，該基因全長約80kb，含8kb的5’區域、10個外顯子、9個內含子和外顯子10之后的8kb的DNA序列。編碼區在外顯子3－10之間，其編碼的蛋白質是CD82。大量實驗結果表明，KAI1／CD82是一個腫瘤轉移抑制基因。KAI1／CD82在細胞上可與各種整合素分子、表皮生長因子受體組成復合體，通過多種信號傳導通路來介導細胞的黏附，使腫瘤細胞不易脫離原發灶而起抑制轉移功能，同時對腫瘤細胞的遷移和在轉移部位的增殖有抑制作用，從而實現抑制腫瘤細胞轉移和侵襲。

3.2 KAI1／CD82的腫瘤抑制作用

Tomoyuki[2]研究發現將抑癌基因與腫瘤轉移抑制基因聯系起來。研究結果表明p53通過與該區域結合從而激活KAI1基因的表達。由于p53失活在許多腫瘤中存在，常會減少p53的轉錄目的基因KAI1的表達。Mashimo[3]研究組從基因啟動子人手，分析了p53和KAI1／CD82基因表達的關系，發現了p53對KAI1／CD82基因表達的正調控作用，同時有效證實了前列腺癌KAI1／CD82陽性和p53陽性存在的一致性。Tsutomu等[4]發現，腫瘤壞死因子－á（TNF－á）通過核因子－JcB（Nuclearfactor，NFJcB）介導能促進KAI1／CEt32的表達，提示KAI1／CD82的表達可能與宿主腫瘤的微環境有關。Dong等[5]的研究表明，KAI1／CD82蛋白的、上皮細胞膜定位和廣泛的糖基化，提示KAI1／CD82蛋白參與細胞與細胞間、細胞與細胞外基質間的反應，KAI1／CD82蛋白對腫瘤轉移的抑制作用可能與其可調節細胞的粘附作用有關。在正常前列腺組織及良性增生組織中CD82分子表現為高表達，且定位于漿膜上間質成分不表達。

3.3 KAI1／CD82的轉移抑制作用與腫瘤

KAI1／CD8在人體的許多組織中表達，在對食管癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等患者的研究過程中，發現KAI1／CD82的表達和腫瘤的轉移密切相關。大多數腫瘤細胞中KAI1／CD82表達下降提示腫瘤轉移的機率增加。Dong等[1]發現KAI1／CD82在正常前列腺高表達，轉移性人前列腺癌細胞株中表達降低或不表達，認為KAI1／CD82的過表達可能限制早期前列腺癌的發展，而它的丟失可能使腫瘤更具有侵襲行為，改變KAI1／CD82的表達在前列腺癌和與癌相關的前列腺增生中有改善預后的重要作用。董良鵬等[6]采用免疫組織化學方法檢測20例成人正常賁門黏膜正常組和51例賁門癌組織中KAI1／CD82蛋白表達的陽性率，結果發現KAI1／CD82蛋白在賁門癌組織的表達與腫瘤的臨床分期浸潤深度和淋巴結轉移有關聯，KAI1／CD82在賁門癌組組織中的表達可作為從分子水平判定人賁門癌組惡性生物學行為的指標。季潤元等[7]應用組織芯片和免疫組織化學技術檢測233例結直腸癌組織中KAI1／CD82的表達，結果發現KAI1／CD82在結直腸癌組織中的表達缺失與腫瘤的分化程度分期密切相關，有望成為判斷結直腸癌預后的新標志。汪庚明等[8]應用PCR法檢測5種人鼻咽癌細胞株、28例鼻咽癌和15例非腫瘤性鼻咽部組織KAI1／CD82mRNA的表達情況，結果發現KAI1／CD82基因在低轉移性人鼻咽癌細胞株中高表達，而在高轉移性人鼻咽癌細胞株中低表達。KAI1／CD82基因在鼻咽癌組織中低表達，在非腫瘤性鼻咽部組織中高表達，提示該基因在鼻咽癌的發生、發展中可能起到一定作用。KAI1／CD82基因在鼻咽癌組織的低表達與鼻咽部淋巴結轉移有關，提示該基因在抑制鼻咽癌轉移的過程中起重要作用。武世伍等[9]采用免疫組化ElivisionTMplus法和特殊組織化學法檢測160例NSCLC和20例正常肺組織中CD82／KAI1的表達情況。結果在正常肺組中CD82／KAI1的表達率明顯高于NSCLC組織；其水平與腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移、臨床分期和術后生存期有關；Kaplan－Meier生存分析表明CD82／KAI1陽性表達的患者生存率明顯高于陰性者。Yu等[10]報道KAI1／CD82與膀胱癌的預后有關，他們發現15例KAI1／CD82陽性患者的總生存率明顯高于25例KAI1／CD82陰性患者。Mashimo等[11]研究了KAI1與p53的關系，也觀察了前列腺癌患者的生存率，發現這兩個標志物缺失使得患者的生存期顯著縮短。

3.4 KAI1／CD82的轉移抑制作用與甲狀腺癌

Chen等[12]用 RT－PCR和免疫組化法研究75例甲狀腺癌患者，發現甲狀腺癌組織中的KAI1／CD82表達比良性甲狀腺組織中的表達水平顯著下降，轉移性瘤組織中KAI1／CD82的表達比非轉移性瘤組織中的KAI1／CD82的表達水平顯著下降，KAI1／CD82表達與腫瘤病理分級、臨床分期呈負相關。本實驗中，我們利用免疫組織化學技術和RTPCR技術檢測了正常甲狀腺組織和不同組織學類型的甲狀腺癌組織中KAI1／CD82蛋白及mRNA的表達水平。在正常甲狀腺中，KAI1／CD82具有很高的表達水平。在甲狀腺癌中的表達水平較正常甲狀腺降低，并隨著其惡性度的增高而顯著降低。KAI1／CD82在惡性度最高的髓樣癌中，免疫組化法幾乎檢測不到KAI1／CD82的表達，提示KAI1／CD82在甲狀腺癌進展中的重要作用。綜合我們的實驗結果，我們認為KAI1／CD82在正常甲狀腺中呈陽性表達，在惡性度高的甲狀腺癌中的表達水平顯著低于正常甲狀腺組織并隨甲狀腺癌的組織學惡性度增加而降低。檢測KAI1／CD82在甲狀腺癌中的表達情況對甲狀腺癌的臨床診斷治療具有一定指導作用和意義，可能成為患者預后推測的重要指標。

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[5]Dong JT，Suzuki H，Pin SS，et al.Down－regulation of the KAI1 metastsissuppressor gene during the progression of human prostatic cancer infre quently involves gene mutation or allelic loss[J].Cancer Res，1996，56（19）：4387.

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